TRANSFORMASI GEN XILOGLUKANASE PADA BEBERAPA JENIS

TRANSFORMASI GEN XILOGLUKANASE PADA BEBERAPA JENIS
EKSPLAN SENGON (Paraserianthes falcataria L. Nielsen) MELALUI
Agrobacterium tumefaciens
Naskah Publikasi
Skripsi
Untuk memenuhi sebagian persyaratan
guna memperoleh gelar Sarjana Sains
Oleh:
Tri Warseno
M0403010
JURUSAN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS SEBELAS MARET
SURAKARTA
2008
PERSETUJUAN
Naskah Publikasi
SKRIPSI
TRANSFORMASI GEN XILOGLUKANASE PADA BEBERAPA JENIS
EKSPLAN SENGON (Paraserianthes falcataria L. Nielsen) MELALUI
Agrobacterium tumefaciens
Oleh:
Tri Warseno
NIM. M0403010
Telah disetujui untuk dipublikasikan
Surakarta,
Menyetujui,
Pembimbing I
Pembimbing II
Prof. Drs. Suranto,M.Sc., Ph.D.
NIP. 131 472 192
Dra. N. Sri Hartati, M.Si.
NIP. 320 006 576
Mengetahui,
Ketua Jurusan Biologi
Dra. Endang Anggarwulan, M.Si.
NIP. 130 676 864
TRANSFORMATION OF XILOGLUCANASE GENE TO SEVERAL
EXPLANT TYPES OF SENGON (Paraserianthes falcataria L. Nielsen)
MEDIATED BY Agrobacterium tumefaciens
Tri Warseno1), Suranto1), Sri Hartati2)
Departement of Biology, Faculty of Mathematics and Natural Sciences
Sebelas Maret University, Surakarta 1)
Research Center For Biotechnology Indonesian Institute of Sciences 2)
ABSTRACT
Sengon (Paraserianthes falcataria L. Nielsen) is one of forestry crop
which have been developed and recommended for Industrial Timber Estate
(HTI). The economic value of this plant such as pulp, raw material of paper
industry (pulp and paper), construction, plywood, and also for energy was
widely known. To increase the wood quality of sengon in industry especially
for the pulp, sengon plantation in which consist higher cellulose were
required. Genetic engineering with the DNA technology for the crop
improvement in which the times taken where much shorten compare to
conventional one. Overexpression of xyloglucanase in poplar (Populus alba)
showed the growth enhancement and improved the cellulose depotition at
secondary xylem so wood quality yielded good progressively. The aim of this
research was to know the result of xyloglucanase gene transformation via
Agrobacterium tumefaciens vector of various explants type of sengon.
Callus, cotyledons and cotyledonary nodes were taken away from
sengon’s seed which germinated on hormon-free MS medium during 10 days
used for transformation. A. tumefaciens carrying recombinant plasmid
pAaXEG 300 bearing xyloglucanase and NPT II gene encoding kanamycin
resistance were used for transformation process. For cocultivation A.
tumefaciens with Optical Density (OD600) = 0,4; 0,6 and 0 (as control) value
was used. For callus induction 1mg TDZ and 0,25 mg/IAA were added to MS
medium respectively. For the selection purpose 300 mg/l kanamycin and 280
mg/l carbenisillin were added to MS medium. The putative transgenic
explants were tested on a gene integration test by PCR methode and the results
was checked by gel electroforesis. Putative transgenic explants then moved to
the somatic embryo induction medium to induce somatic embryo forming.
The results showed that the OD600 0,4 value showed much better than
OD600= 0,6 for the all of explants used, accordingly callus yielded highest
transformation efficiency value ( 40 %). PCR products examined, resulting
showed that six of the nine samples tested showed positif, indicating that
xyloglucanase gene has successfully integrated on the plant tissue.
Key words:
xyloglucanase,
transformation
Paraserianthes
falcataria, explant types,
PENDAHULUAN
Salah satu tanaman kehutanan yang dikembangkan sebagai salah satu
komoditi HTI (Hutan Tanaman Industri) adalah sengon (Paraserianthes falcataria
L. Nielsen). Sengon mempunyai beberapa keunggulan yaitu dapat tumbuh dengan
cepat di daerah tropis, pada tanah miskin hara dan drainase yang kurang baik.
Sifatnya yang dapat tumbuh cepat sangat sesuai digunakan untuk reboisasi dan
penghijauan lahan-lahan kritis (Santoso, 1992). Kayu sengon merupakan salah
satu kayu yang banyak dimanfaatkan dalam produksi pulp dan kertas. (Nemoto,
2002).
Kayu sengon dapat digunakan untuk menghasilkan pulp yang berkualitas
karena kayu sengon memiliki berat jenis 0,49 dengan tingkat keawetan dan
kekuatannya tergolong ke dalam kelas awet IV/V dan kelas kuat IV/V (Hidayat, et
al., 2002). Selain itu karena warnanya yang terang, hanya sedikit proses bleaching
yang diperlukan untuk mendapatkan kertas putih yang baik kualitasnya (Nemoto,
2002). Untuk peningkatan pertumbuhan dan kualitas kayu sengon sebagai bahan
baku industri pulp maka diperlukan perbanyakan dan perbaikan sifat sengon
melalui rekayasagenetika. Rekayasa genetika dengan penerapan teknologi DNA
melalui transformasi genetik merupakan teknologi alternatif untuk perbaikan
tanaman dalam waktu yang relatif singkat (Siregar, 2002).
Adanya keterlibatan proses pemutusan ikatan xiloglukan dalam proses
elongasi (pemanjangan) sel, telah terbukti dengan adanya penemuan terdahulu
mengenai proses integrasi oligosakarida xiloglukan kedalam segmen-segmen
batang kacang polong (Pisum sativum) yang ternyata dapat melonggarkan dinding
sel dan mempercepat proses pemanjangan sel (elongasi). Overekspresi
xiloglukanase pada poplar (Populus alba) yaitu sejenis tanaman berkayu di daerah
subtropik terbukti dapat memacu
pertumbuhan dan meningkatkan deposisi
selulosa pada xylem sekunder sehingga kualitas kayu yang dihasilkan semakin
baik (Park et al., 2004). Tujuan dari penelitian ini adalah mengetahui hasil
transformasi gen xiloglukanase menggunakan vektor Agrobacterium tumefaciens
pada beberapa jenis eksplan tanaman sengon..
BAHAN DAN METODE
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini berlangsung dari bulan Mei 2007 – Januari 2008 di di
Laboratorium Biologi Molekuler Pusat Penelitian Bioteknologi LIPI (Lembaga
Ilmu Pengetahuan Indonesia) Cibinong, Jawa Barat.
Penentuan Sensifitas Eksplan terhadap Antibiotik Kanamisin
Eksplan ditanam pada media MS yang mengandung beberapa tingkat
konsentrasi kanamisin, yaitu 0, 100, 200, 300, 400, dan 500 mg/l (masing-masing
15 eksplan). Pengamatan dilakukan setelah 4 minggu untuk mengetahui
pertumbuhan eksplan pada masing-masing tingkat konsentrasi.
Transformasi
Proses transformasi dilakukan dengan cara merendam eksplan (bagian
buku kotiledon, kotiledon dan kalus) dalam larutan bakteri Agrobacterium
tumefaciens dengan OD600 (Optical Density) = 0,4 dan 0,6 selama 5 menit. Semua
permukaan eksplan harus terendam oleh larutan bakteri tersebut. Eksplan
diletakkan di atas kertas saring steril untuk menyerap sisa bakteri dan dibiarkan
sampai mengering. Selanjutnya eksplan dikokultivasi pada media ½ MS selama +
24 jam (overnight) (Sudarmonowati dkk. (2005).
Seleksi dan Induksi Kalus Embriogenik Hasil Transformasi
Eksplan yang telah dikokultivasi dipindah kedalam cawan yang berisi
media induksi kalus. Media yang digunakan adalah media MS + 1 mg/l TDZ +
0,25 mg/l IAA (Tampubolon, 2007). Untuk media seleksi ditambahkan dengan
antibiotik yang mengandung 300 mg/l kanamisin serta 280 mg/l karbenisilin.
Kemudian eksplan diinkubasi dalam ruang kultur pada suhu 25 oC. Pengamatan
dilakukan untuk mengetahui jumlah eksplan yang bertahan dan mampu
membentuk kalus serta memberikan respon embriogenik. Eksplan yang dapat
bertahan pada media seleksi adalah putative transgenic yang akan diuji lebih
lanjut dengan PCR.
Uji Integrasi Gen Melalui PCR
Isolasi DNA tanaman dilakukan dengan menggunakan metode CTAB
berdasarkan Gillies et al.(1997) dengan penambahan PVP. Sebanyak 17,5 µl
akuades steril dimasukkan ke dalam tabung propilen 500 µl dan diikuti berturutturut dengan 2,5 µl PCR buffer 10 X; 1 µl MgCl2; 1 µl DNA template; 1 µl
forward primer;1 µl reverse primer; 0,5µl dNTP mix dan 0,5 µl enzim
polymerase (Invitrogen). Setelah ditutup komponen tersebut dicampur dengan
cara disentrifus dengan kecepatan 5000 rpm selama 1 menit. Kemudian tabung
propilen dimasukkan ke dalam mesin PCR untuk dilakukan amplifikasi. Primer
yang digunakan untuk amplifikasi:
1). Forward primer: 5’- GCTGCCAGTCTAGAGCGCCGCAGCGAC-3’,
2). Reverse primer: 3’- CAACGCACC TGGCGCCGGACTGCCCTC-5’
Kondisi PCR yang digunakan adalah denaturasi awal dilakukan pada suhu
95 oC selama 60 detik, denaturasi untuk siklus dilakukan pada suhu 95 oC selama
30 detik, kemudian diikuti dengan annealing pada suhu 56 oC selama 45 detik dan
elongasi pada suhu 72 oC selama 60 detik. Siklus ini diulang untuk 30 siklus dan
diikuti dengan elongasi akhir pada suhu 72 oC selama 7 menit. Hasil PCR diuji
melalui elektroforesis gel agarose. Gel agarose dibuat dengan konsentrasi 0,8 %.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Optimasi Media Seleksi
Untuk mengetahui sensitifitas eksplan tanaman P. falcataria terhadap
antibiotik kanamisin dan penggunaan antibiotik kanamisin yang tepat untuk media
seleksi, dilakukan percobaan dengan menumbuhkan eksplan tanaman P.
falcataria pada media MS dengan penambahan beberapa tingkat konsentrasi
kanamisin. Sensitivitas eksplan P. falcataria terhadap antibiotik kanamisin dapat
dapat dilihat pada Tabel 1.
Tabel 1. Hasil uji sensitivitas eksplan sengon terhadap kanamisin (n =15)
Konsentrasi
Kanamisin (mg/l)
0
100
200
300
400
500
600
Jumlah dan persentase (%) eksplan mati pada minggu ke1
2
3
0/15 (0)
0/15 (0)
0/15 (0)
0/15 (0)
0/15 (0)
0/15 (0)
0/15 (0)
0/15 (0)
3/15 (20)
0/15 (0)
5/15 (33,33)
10/15 (66,67)
3/15 (20)
11/15 (73,33)
15/15 (100)
5/15 (33,33)
13/15 (86,67)
15/15 (100)
15/15 (100)
15/15 (100)
15/15 (100)
*) Keterangan: Angka di dalam kurung menunjukkan persentase
4
0/15 (0)
2/15 (13,33)
5/15 (33,33)
15/15 (100)
15/15 (100)
15/15 (100)
15/15 (100)
Dari penelitian optimasi media seleksi ini, dihasilkan bahwa antibiotik
kanamisin dengan konsentrasi 300 mg/l dapat digunakan sebagai konsentrasi
minimal yang dapat menghambat pertumbuhan dan merupakan konsentrasi lethal
minimum pada eksplan sengon, sehingga kanamisin dengan konsentrasi tersebut
dapat digunakan untuk menyeleksi kalus transforman yang resisten terhadap
kanamisin.
Optimasi Media Induksi Embrio Somatik
Media untuk menginduksi terbentuknya embrio somatik merupakan salah
satu aspek yang memegang peranan penting dalam penelitian transformasi gen
pada tanaman. Eksplan yang telah ditransformasi diharapkan dapat berkembang
dan beregenerasi membentuk embrio somatik atau tanaman utuh (planlet). Hasil
pengamatan secara visual perkembangan kalus pada 6 media induksi embrio
somatik pada minggu ke-4 setelah tanam dapat dilihat pada Tabel 2 dan Gambar
1.
Tabel 2.
Penampakan visual perkembangan kalus pada media induksi embrio
somatik pada minggu ke-2 setelah tanam.
Media
Penampakan visual kalus
Struktur
Warna
Diameter
Respon SE
M1
Friable
Hijau kekuningan
< 15 mm
M2
Friable
Hijau kekuningan
< 15 mm
M3
Friable
Hijau kekuningan
> 15 mm
M4
Friable
Hijau kekuningan
> 15 mm
M5
Friable
Hijau kekuningan
> 15 mm
M6
Friable
Hijau kekuningan
> 15 mm
+
*) Keterangan: (+) Kalus memberikan respon terbentuknya embriogenesis somatik
(-) Kalus tidak memberikan respon terbentuknya embriogenesis somatik
Struktur kalus pada semua jenis media secara umum tidak menunjukkan
perbedaan. Kalus yang muncul strukturnya friable (remah) dan berwarna hijau
kekuningan. Dari 6 jenis media yang digunakan hanya media M6 (Media MS +
0,1 mg/l TDZ + 0,25 mg/l IAA) yang merespon terjadinya embriogenesis somatik
dengan ditandai terbentuknya struktur seperti embrio pada beberapa eksplan.
Berdasarkan optimasi media pendewasaan ini eksplan yang telah lolos selanjutnya
dipindahkan ke media induksi yang responsif membentuk embrio somatik yaitu
media M6 (Media MS + 0,1 mg/l TDZ + 0, 25 mg/l IAA ).
A
B
C
D
E
F
Gambar 1.
Keterangan:
Hasil Pengamatan Visual Optimasi Media Induksi Embriogenesis Somatik.
A: Media MS0; B: Media ½ MS; C: Media MS + 0,1 mg/l TDZ; D: Media MS +
0,46 µM Kinetin; E: Media MS + 0,1 mg/l TDZ + 0,46 µM Kinetin; F: Media
MS + 0,1 mg/l TDZ + 0, 25 mg/l IAA
Hasil seleksi eksplan yang telah ditransformasi
Setelah 8 minggu pada media seleksi dilakukan pengamatan untuk
mengetahui persentase dari masing-masing parameter. Hasil analisis data untuk
masing-masing perlakuan dapat dilihat pada tabel 3 berikut.
Tabel 3. Hasil seleksi eksplan setelah 8 minggu pengamatan
Nilai
Kerapatan
Bakteri
Jenis Eksplan
Persentase
Rata-Rata
Eksplan
Bertahan (%)
Persentase RataPersentase
Persentase
Rata Eksplan
Rata-rata
Rata-Rata
mengalami
Eksplan
Eksplan
Overgrowth
Nekrosis (%)
membentuk
(%)
kalus (%)
OD600 = 0
Kalus
100 a
0a
0 a
88 de
a
a
a
(Kontrol)
Kotiledon
94
0
6
94 e
a
a
a
Buku kotiledon
92
0
8
80 d
b
bc
b
OD600 = 0,4 Kalus
40
30
30
28 bc
b
b
b
Kotiledon
38
26
36
24 b
b
bc
b
Buku kotiledon
38
28
34
34 c
c
c
b
OD600 = 0,6 Kalus
26
42
32
10 a
c
bc
b
Kotiledon
24
40
34
20 b
c
bc
b
Buku kotiledon
26
40
34
24 b
*)
Keterangan: Angka yang diikuti dengan huruf yang sama pada satu kolom menunjukkan tidak
beda nyata pada uji DMRT dengan taraf uji 5 %.
Persentase eksplan yang bertahan pada media seleksi
Perubahan morfologi pada eksplan hasil transformasi mulai terlihat setelah
1 minggu dalam media seleksi yang mengandung kanamisin 300 mg/l, dimana
beberapa eksplan mulai mengalami pencoklatan, nekrosis atau membusuk.
Eksplan tersebut merupakan eksplan yang diduga tidak tertransformasi sehingga
tidak mampu bertahan dalam media yang mengandung kanamisin sedangkan
eksplan yang tertransformasi tetap segar (berwarna hijau) (Gambar 2).
A
B
Gambar 2.
Keterangan:
Perbandingan kalus putative transgenic dan yang nekrosis
A. Eksplan putative transgenic (masih tetap berwarna hijau dan membentuk
kalus baru)
B Eksplan yang tidak tertransformasi (berwarna coklat dan mengalami nekrosis
Hasil analisis sidik ragam (Anava) menunjukkan bahwa perbedaan nilai
kerapatan bakteri (Nilai OD) dan jenis eksplan menunjukkan pengaruh yang
signifikan terhadap persentase rata-rata eksplan bertahan (p < 0,05). Setelah
dilakukan Uji DMRT pada taraf uji 5 % menunjukkan bahwa nilai OD
menunjukkan pengaruh yang berbeda nyata pada persentase ekspan transforman
yang dapat bertahan pada media seleksi. Sebaliknya jenis eksplan tidak
menunjukkan pengaruh yang berbeda nyata terhadap kemampuan eksplan untuk
bertahan pada media seleksi.
Berdasarkan dari hasil seleksi eksplan hasil transformasi pada media
seleksi yang diberi 300 mg/l kanamisin diketahui bahwa persentase hidup eksplan
pada setiap perlakuan ternyata menunjukkan jumlah yang cukup rendah,
sedangkan eksplan yang ditumbuhkan pada media tanpa antibiotik (kontrol),
ternyata dapat tumbuh dan mampu membentuk kalus yang lebih baik. Hal ini
menunjukkan adanya proses seleksi terhadap sel-sel eksplan oleh kanamisin yang
digunakan pada media seleksi dan penambahan antibiotik kanamisin 300 mg/l
pada media seleksi sudah cukup efektif untuk menyeleksi sel-sel transforman pada
sengon.
Persentase Eksplan Tahan
100
94
100
92
90
Persentase (%)
80
70
OD 600= 0
OD 600= 0,4
OD 600= 0,6
60
50
40
26
30
38
38
40
26
24
20
10
0
Kalus
Kotiledon
Buku Kotiledon
Jenis Eksplan
Gambar 3.
Persentase (%) eksplan yang bertahan pada media seleksi (setelah 8 minggu
pengamatan
Adanya eksplan yang mengalami pertumbuhan dan perkembangan setelah
transformasi
dan ditanam
di
media seleksi
merupakan indikasi
awal
terintegrasinya T-DNA dari plasmid yang membawa gen resisten terhadap
antibiotik kanamisin (npt II) ke dalam sel-sel eksplan karena resistensi eksplan
tersebut merupakan ekspresi dari gen npt II.
Persentase kontaminasi oleh Agrobacterium (overgrowth)
Setelah 7-10 hari dipindah ke media seleksi (1 mg/l
TDZ + mg/l 0,25
IAA + 300 mg/l kanamisin + 280 mg/l karbenisilin) eksplan ditumbuhi oleh
bakteri A. tumefaciens sehingga menyebabkan tanaman mengalami gangguan
pertumbuhan dan akhirnya mati. Hal tersebut dapat disebabkan oleh terjadinya
pertumbuhan bakteri yang berlebih (overgrowth) yang mengakibatkan tingkat
kompetisi bakteri sangat tinggi dan pertumbuhan eksplan terhambat atau mati
sehingga proses infeksi tidak efektif (Siswanto dkk., 1997).
Persentase Eksplan Mengalami Overgrowth
45
42
40
40
Persentase (%)
40
35
30
28
30
26
OD 600= 0
OD 600= 0,4
OD 600= 0,6
25
20
15
10
5
0
0
0
0
Kalus
Kotiledon
Buku Kotiledon
Jenis Eksplan
Gambar 4.
Persentase (%) eksplan yangmengalami overgrowth pada media seleksi (setelah 8
minggu pengamatan
Hasil penelitian dengan perbedaan nilai OD dan jenis eksplan pada
eksplan yang ditransformasi menunjukkan pengaruh yang berbeda nyata terhadap
persentase rata-rata eksplan yang overgrowth apabila dibandingkan dengan
kontrol. Kerapatan bakteri dengan nilai OD600 = 0,6 menghasilkan eksplan dengan
tingkat overgrowth yang lebih tinggi daripada OD600 = 0,4 pada semua jenis
eksplan yang digunakan. Hal tersebut diduga karena pada OD600 = 0,6 kerapatan
bakteri terlalu tinggi sehingga bakteri tumbuh secara berlebih dan akhirnya
mengkontaminasi eksplan, mengakibatkan pertumbuhan terganggu bahkan
kematian eksplan.
Persentase Eksplan yang Nekrosis
Nekrosis dan kematian sel pada jaringan tanaman merupakan salah satu
faktor yang dapat mempengaruhi efisiensi transformasi yang diperantarai oleh
Agrobacterium (Gustavo et al., 1998). Tingkat reaksi nekrosis dilaporkan
tergantung pada beberapa parameter transformasi, meliputi jenis dan usia eksplan,
waktu prakultur, densitas inokulum bakteri dan lamanya infeksi, jenis dan
konsentrasi agen penyeleksi yang digunakan.
Persentase Ekplan Nekrosis
40
36
Persentase (%)
35
30
34
34
32
34
30
25
OD 600= 0
20
OD 600= 0,4
OD 600= 0,6
15
8
10
6
5
0
0
Kalus
Kotiledon
Buku Kotiledon
Jenis Eksplan
Gambar 5. Persentase (%) eksplan yang mengalami nekrosis (setelah 8 minggu
pengamatan
Hasil penelitian menunjukkan bahwa perlakuan nilai OD dan jenis eksplan
tidak berpengaruh secara nyata pada persentase eksplan yang nekrosis pada
eksplan transforman yang ditransformasi dengan menggunakan nilai OD600= 0,4
dan 0,6. Tetapi apabila dibandingkan dengan tanaman kontrol hasilnya
menunjukkan pengaruh yang beda nyata (Tabel 3). Berdasarkan hasil statistik
tersebut diduga bahwa proses transformasi mempengaruhi kondisi eksplan setelah
kokultivasi salah satunya adalah nekrosis pada eksplan.
Persentase Eksplan yang membentuk Kalus
Kemampuan eksplan untuk membentuk kalus pada media seleksi
merupakan salah satu parameter dari keberhasilan proses transformasi. Hal
tersebut menunjukkan bahwa eksplan yang tumbuh dan membentuk kalus
merupakan sel-sel yang telah berhasil tertransformasi dan ada indikasi untuk dapat
beregenerasi menjadi planlet. Hasil analisa data secara statistik menunjukkan
bahwa perbedaan kerapatan bakteri dan jenis eksplan memberikan pengaruh yang
berbeda nyata pada persentase eksplan yang membentuk kalus.
Perbandingan
persentase
ekslan
yang mampu
membentuk
kalus
ditunjukkan pada Gambar 6. Pada eksplan yang ditransformasi persentase eksplan
yang dapat membentuk kalus baru tertinggi adalah yang berasal dari buku
kotiledon. Pada eksplan yang berasal dari kalus, kemampuan untuk membentuk
kalus yang baru lebih rendah daripada buku kotiledon. Hal tersebut dapat
disebabkan karena usia kalus yang sudah dewasa ketika ditransformasi sehingga
lebih sulit berproliferasi untuk membentuk kalus yang baru dibandingkan dengan
buku kotiledon yang mungkin lebih aktif dalam pembelahan sel.
Persentase Eksplan Membentuk Kalus
100
90
94
88
80
Persentase (%)
80
70
60
OD600= 0
50
40
OD600= 0,4
34
28
24
30
24
20
20
OD600= 0,6
10
10
0
Kalus
Kotiledon
Buku Kotiledon
Jenis Eksplan
Gambar 6.
Persentase (%) eksplan yang membentuk kalus (setelah 8 minggu pengamatan
1A
1
1B
2A
2
Gambar 7.
Keterangan:
2B
Morfologi eksplan hasil transformasi dan kontrol setelah 8 minggu pengamatan.
1. Eksplan hasil transformasi dengan nilai OD600= 0,4
2. Eksplan hasil transformasi dengan nilai OD600= 0,6
A. Eksplan kontrol
B. Eksplan hasil transformasi
(XEG = Xiloglukanase)
Bila dibandingkan dengan tanaman kontrol, terlihat bahwa proses
transformasi mempengaruhi kemampuan eksplan dalam membentuk kalus. Selain
itu kalus yang berasal dari eksplan yang telah ditransformasi menunjukkan
pertumbuhan yang lebih rendah daripada kalus yang tidak ditransformasi (kontrol)
(Gambar 13). Hal ini diduga karena perlakuan transformasi dan insersi gen asing
ke dalam kromosom tanaman menyebabkan tanaman mengalami stress, sehingga
menghambat pertumbuhan dan daya regenerasinya.
Efisiensi Transformasi
Efisiensi transformasi merupakan salah satu parameter untuk mengetahui
keberhasilan transformasi gen pada tanaman. Pada penelitian ini nilai efisiensi
transformasi dihitung dengan membandingkan jumlah eksplan yang bertahan pada
medium seleksi pada akhir pengamatan dengan jumlah eksplan yang
dikokultivasi.
Tabel 4. Nilai efisiensi transformasi berdasarkan ketahanan kalus pada media seleksi (pengamatan
minggu ke-10).
Nilai Kerapatan
Bakteri
OD600 = 0,4
Jenis
Efisiensi Transformasi
Eksplan
(%)
Kalus
40
Kotiledon
36
Buku kotiledon
38
OD600 = 0,6
Kalus
24
Kotiledon
20
Buku kotiledon
25
*) Keterangan: Jumlah eksplan yang ditransformasi setiap perlakuan 50 eksplan
Berdasarkan hasil pengamatan terhadap parameter transformasi terutama
persentase eksplan yang mampu bertahan pada media seleksi setelah 10 minggu
pengamatan, nilai efisiensi transformasi yang diperoleh pada masing-masing
perlakuan seperti yang ditunjukkan pada Tabel 4. Nilai efisiensi transformasi
tertinggi terdapat pada eksplan kalus yang ditransformasi menggunakan
Agrobacterium tumefaciens
dengan nilai OD600= 0,4 yaitu 40 % dan nilai
efisiensi transformasi yang terendah terdapat pada kotiledon yang ditransformasi
dengan nilai OD600= 0,6 yaitu 20 %.
Pertumbuhan dan perkembangan eksplan hasil transformasi pada media
induksi embrio somatik
Setelah 8 minggu ditanam pada media seleksi, kalus yang terbentuk
dipindahkan ke media perkembangan kalus, yaitu media MS ditambah dengan 0,1
mg/l TDZ dan 0,25 mg/l IAA (berdasarkan hasil optimasi media induksi) untuk
menginduksi terbentuknya embrio somatik. Pada media pendewasaan beberapa
eksplan baik kontrol maupun yang telah ditransformasi muncul beberapa struktur
yang menyerupai embrio setelah 3-4 minggu setelah tanam (Gambar 8).
1A
1B
2A
2B
2D
Gambar 8.
Keterangan:
2E
1C
2C
2F
Beberapa struktur seperti embrio yang muncul pada media induksi embrio somatik.
1A-1C = non transforman
2A-2F = transforman
Jumlah eksplan yang mampu membentuk embrio somatik pada media
pendewasaan pada penelitian ini masih terlalu sedikit. Dari 100 eksplan yang
dipindahkan ke media induksi hanya 9 ekplan yang dapat membentuk struktur
yang menyerupai embrio. Belum optimalnya pembentukan embrio somatik dalam
penelitian ini diduga karena belumnya tepatnya kualitas eksplan yang digunakan.
Ketidakmampuan eksplan untuk membentuk embrio somatik mungkin
disebabkan karena faktor media yang kurang optimal untuk meregenerasikan
kalus setelah transformasi. Jenis dan konsentrasi zat pengatur tumbuh yang kurang
tepat mungkin termasuk di dalam faktor yang menyebabkan eksplan tidak mampu
membentuk embrio somatik secara optimal. Hal tersebut dapat dilihat pada
perlakuan kontrol yaitu kalus yang tidak mengalami transformasi ternyata juga
tidak dapat membentuk embrio somatik secara optimal dan embrio somatik yang
terbentuk hanya mencapai fase nodular/globular dan kemudian mengalami
pengkalusan lagi.
Penyebab lain rendahnya daya regenerasi eksplan transforman mungkin
dikarenakan adanya senyawa/ agen penyeleksi antibiotik pada media regenerasi.
Sel yang tidak mengandung gen ketahanan terhadap antibiotik tentunya akan
terseleksi dan mati, sebaliknya sel eksplan yang telah tertransformasi gen
ketahanan terhadap antibiotik akan lolos seleksi dan tumbuh terus dan dapat
membentuk embrio somatik. Penggunaan sistem seleksi antibiotik dilaporkan
sering menyebabkan kebanyakan sel yang tertransformasi tidak atau sulit
beregenerasi (Yu, et al., 2001; da Silva, et al., 2001). Hal tersebut diduga karena
adanya penghambat pertumbuhan atau toksin yang dikeluarkan dari sel nontransgenik yang mati, atau karena terganggunya transportasi senyawa esensial
melalui jaringan mati tersebut (Haldrup et al., 1998).
Konsentrasi antibiotik yang digunakan untuk menghambat pertumbuhan
Agrobacterium setelah proses kokultivasi pada umumnya tinggi dan mungkin
mempengaruhi kultur tanaman dengan menghambat atau dapat juga meningkatkan
pertumbuhan dan regenerasi eksplan. Penelitian transformasi gen pada tanaman
pepaya (Yu, et al., 2001), kedelai (Wiebkie et al., 2006), Chrysanthemum dan
tembakau (da Silva, et al., 2001) yang menggunakan karbenisilin untuk
menghambat pertumbuhan A. tumefaciens setelah proses kokultivasi melaporkan
bahwa terjadi penurunan pertumbuhan kalus dan kemampuan eksplan untuk
membentuk embrio somatik yang cukup signifikan.
Uji Integrasi Gen Melalui PCR
Keberhasilan
transformasi
genetik
tanaman
ditandai
dengan
terintegrasinya gen yang diintroduksikan ke dalam genom tanaman dan
terekspresi serta tetap terpelihara dalam seluruh proses pembelahan sel sampai
regenerasi tanaman. Analisis secara molekuler dimaksudkan untuk mengetahui
keberhasilan proses transfer gen xiloglukanase pada tanaman sengon hasil
transformasi. Setelah eksplan berumur 8 (delapan) minggu di media seleksi,
dilakukan isolasi DNA genom dan dianalisa dengan uji PCR untuk mendeteksi
keberadaan gen xiloglukanase dalam genom eksplan tersebut.
1
bp
2
3
4
5
6
7
8
9
1
2
3
4
5 6
7
8
9 10 11
12000
2000
1650
A
B
650
Gambar 9.
A. DNA genom sengon hasil transformasi (2-5) dan kontrol ( 6-9)
B. DNA genom sengon hasil transfomasi (4-11) dan kontrol (1-3) (ulangan)
Hasil isolasi DNA pada Gambar 9 (A dan B) menunjukkan adanya pita
DNA yang diisolasi dari genom tanaman sengon. Ukuran DNA genom yang
diperoleh cukup besar dan banyak, yang ditandai dengan terlihatnya pita hasil
elektroforesis yang terang (tanda panah) dan dilihat dari dekatnya jarak migrasi
pita DNA. Berdasarkan hasil tersebut diketahui bahwa ukuran DNA genom
sengon lebih dari 12000 bp. Namun demikian, disamping DNA genom sengon
utuh sebagian ada yang terdegradasi yang tampak sebagai usapan (smear) di
bawah pita yang terang. Hal tersebut mungkin dikarenakan adanya degradasi dan
kerusakan DNA selama proses ekstraksi dan pemurnian DNA.
Uji PCR dilakukan dengan menggunakan primer spesifik untuk gen
xiloglukanase. DNA template diperoleh dari 9 eksplan putative transgenic dan 1
eksplan yang tidak ditransformasi sebagai kontrol.
bp
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
12000
5000
2000
1650
1000
850
709
650
500
400
300
200
100
Gambar 17. Hasil uji integrasi gen dengan PCR yang menunjukkan pita DNA berukuran 709 bp.
1. Marker /1 kb plus DNA Ladder (Invitrogen); 2. Plasmid XEG; 3-11. Tanaman
yang ditransformasi; 12. Tanaman kontrol; 13. Kontrol negatif PCR.
Hasil analisis PCR dari ketiga jenis eksplan yang resisten pada media
seleksi dapat dilihat pada Gambar 10. Dari 9 sampel tanaman putatif transgenic
diperoleh 6 sampel yang positif mengandung sisipan gen xiloglukanase. Dengan
adanya sampel yang menunjukkan pita berukuran 709 bp tersebut menunjukkan
bahwa gen xiloglukanase telah berhasil diintroduksikan ke dalam genom tanaman
sengon (P. falcataria (L.) Nielsen) melalui A. tumefaciens.
Untuk mengetahui keberhasilan introduksi gen dan kestabilannya pada
genom tanaman sebaiknya perlu dilakukan uji integrasi gen dengan PCR kembali
pada planlet hasil regenerasi dari kalus yang resisten kanamisin atau uji ekpresi
gen dengan menggunakan teknik Western Blott.
KESIMPULAN
Berdasarkan hasil penelitian yang diperoleh, Pada tahap transformasi
penggunaan kerapatan bakteri pada nilai OD600= 0,4 menunjukkan hasil yang
lebih baik daripada OD600= 0,4. Pada penelitian ini penggunaan antibiotik
kanamisin dengan konsentrasi 300 mg/l sudah cukup efektif untuk menyeleksi selsel transforman pada sengon. Pada tahap induksi embrio somatik menunjukkan
bahwa media induksi embrio somatik yang dapat membentuk struktur seperti
embrio adalah media MS + 0,1 mg/l TDZ + 0,25 mg/l IAA. Perbedaan jenis
eksplan dan kerapatan bakteri yang digunakan pada proses transformasi
berpengaruh terhadap keberhasilan transformasi gen xiloglukanase pada tanaman
sengon. Hasil analisa PCR menunjukkan 6 sampel
positif terdapat gen
xiloglukanase dari 9 eksplan yang resisten kanamisin.
DAFTAR PUSTAKA
Da Silva, J.A.T., Fukai, S. 2001. “The Impact of Carbenisilin, Cefotaxime and
Vancomycin on Chrysanthemum and Tobacco TCL Morphogenesis and
Agrobacterium Growth”. J. Appl.Hort. 3(1): 3-12.
Gustavo A. de la Riva, J.G., Cabrera, R.V., Padron and C.A., Pardo. 1998.
Agrobacterium tumefaciens: A natural tool for plant transformation. EJB
Electronic J. of Biotech. 1 (3): 118-133.
Haldrup, A., S.G. Petersen, and F.T. Okkels. 1998. Positive selection: A plant
selection principle based on xylose isomerase, an enzyme used in the food
industry. Plant Cell Report 18: 76-81.
Hidayat , J.P. irianto., P. Ochsner dan IFSP. 2002. Informasi Singkat Benih P.
falcataria L. Nielsen. Direktorat Perbenihan Tanaman Kehutanan,
Bandung.
Nemoto, A. 2002. Farm Tree Planting and The Wood Industry In Indonesia: A
Study of Falcataria Plantations and The Falcataria Product Market in Java.
Policy Trend Report 2002: 42-51.
Park, Y.W.,Baba, K., Furuta, Y., Iida, I., Sameshima, K., Arai, M., Hayashi, T.
2004. “Enhanchement of Growth and Cellulose Accumulation by
Overexpression of Xyloglucanase in Poplar”. FEBS Letters 564 (2004) 183187.
Santoso, H.B. 1992. Budidaya Sengon. PT Kanisius (Anggota IKAPI),
Yogyakarta.
Siregar, E.B.M.S. 2002. Crop Improvement Via Genetic Engineering ( Perbaikan
Tanaman Via Rekayasa Genetika). Fakultas Pertanian Program Studi
Kehutanan Universitas Sumatera Utara, Medan.
Sudarmonowati, E., Hartati, S., Hartati, R., Park, Y.W., dan Hayashi, T.2005.
“Expression of Cellulase Gene in Paraserianthes falcataria.” Proceedings
of the 6 th International Wood Science Symposium LIPI-JSPS Core
University Program in The Field of Wood Science. August 29-31 2005.
388-394.
Tampubolon, C. 2007. Aplikasi Stek Pucuk, Kultur Jaringan, Induksi
Embriogenesis Somatik dan Analisis Isozim pada Program Bioteknologi
Sengon. Tugas Akhir. Program Diploma III Budidaya Hutan Tanaman
Fakultas Kehutanan. Institut Pertanian Bogor, Bogor.
Gillies, A.C.M., Cornellius., J.P., Newton, A.C., Navaro, C., Hernandez, M. And
Wilson, J. 1997. Genetic variation in Costa Rica population of Tropical
timber species Cedrela odorata L. Assesed using RAPDs. Molec. ecol
6:1113-1115.
Wiebkie, B., Ferreira, F., Pasquali, G., Zanettini, MHB., Droste, A. 2006.
“Influence of antibiotic on embryogenic tissue and Agrobacterium
tumefaciens suppression in soybean genetic transformation.” Bragantia,
Campinas 65 (4): 543-551.
Yu, T.A., Yeh, S.D., Yang, J.S. 2001. “Effects of carbenisilin and cefotaxime on
callus growth and somatic embryogenesis from adventitious roots of
papaya”. Botanical Bulletin of Academia Sinica 42: 281-286.