tugas dasar bioteknologi

TUGAS DASAR BIOTEKNOLOGI
Nama : ONEL TABUNI
NIM : 115100606111001
Kelas : K
Teknik Rekayasa Genetika
1.Jelaskan pengertian DNA Sekuensing
Sekuensing DNA atau pengurutan DNA adalah proses atau teknik penentuan urutan
basanukleotida pada suatu molekul DNA. Urutan tersebut dikenal sebagai sekuens DNA,
yang merupakan informasi paling mendasar suatu gen atau genom karena mengandung
instruksi yang dibutuhkan untuk pembentukan tubuh makhluk hidup. Sekuensing DNA
dapat dimanfaatkan untuk menentukan identitas maupun fungsi gen atau fragmen DNA
lainnya dengan cara membandingkan sekuens-nya dengan sekuens DNA lain yang sudah
diketahui.Sekuens DNA menyandikan informasi yang diperlukan bagi Makhluk hidup
untuk melangsungkan hidup dan berkembang biak. Dengan demikian, penentuan sekuens
DNA berguna di dalam ilmu pengetahuan 'murni' mengenai mengapa dan bagaimana
makhluk hidup dapat hidup, selain berguna dalam penerapan praktis. Karena DNA
merupakan ciri kunci makhluk hidup, pengetahuan akan sekuens DNA dapat berguna
dalam penelitian biologimanapun. Pengetahuan akan sekuens DNA berguna untuk
mengetahui sekuens asam amino yang disandikan oleh gen.
2. Jelaskan Pengertian Hibridisasi!
Hibridisasi adalah pembentukan ikatan dupleks stabil antara dua rangkaian nukleotida
yang saling komplementer melalu perpasangan basa N. Teknik hibridisasi didasarkan
pada kemampuan urutan asam nukleat yang komplemen untuk berikatan satu sama lain.
Dengan hibridisasi fragmen DNA tertentu dapat diidentifikasi dan dipisahkan dari
fragmen lain.Aplikasi utama dari hibridisasi adalah penelitian tentang regulasi gen.
3. Jelaskan prinsip kerja southern blot,northern blot,western blot!
Sebutkan pesamaan dan perbedaannya!
a. prinsip kerja southern blot!
Southern blot adalah suatu teknik yang dikembangkan oleh Edwin. M. Southern pada
1975, seorang ahli biologi asal Inggris. Teknik ini digunakan untuk pendeteksian suatu
DNA sequence spesifik (gen atau lain) dalam sample kompleks DNA (selular DNA). Ini
juga digunakan untuk menentukan bobot molekular suatu restriksi fragmen dan untuk
mengukur sejumlah relatif dalam sample berbeda. Di bawah kondisi-kondisi optimal,
Southern blot mendeteksi ~ 0.1 pg DNA yang menarik. Blot teknik digunakan untuk
memindahkan protein DNA dan RNA ke suatu pengangkut sehingga dapat dipisahkan,
dan sering juga diikuti penggunaan suatu gel ectrophoresis. Southern blot digunakan
untuk memindahkan DNA. Digunakan biologi molekular untuk melihat kemungkinan
kehadiran suatu urutan DNA dalam suatu sample DNA. Southern blot Selatan
berkombinasi gel agarose electrophoresis untuk separasi ukuran DNA dengan metoda
untuk memindahkan DNA ke suatu membran filter untuk pemeriksaan hybridisasi.
b. prinsip kerja northern blot!
Northern blot merupakan Teknik yang digunakan untuk melihat ekspresi (transkripsi)
suatu mRNA pada organ atau jaringan tertentu. Teknik ini pada dasarnya adalah
kombinasi dari denaturasi RNA elektroforesis gen dan sebuah noda. Dalam proses ini
RNA dipisahkan berdasarkan ukuran dan kemudian ditransfer ke membran untuk
kemudian diperiksa dengan pelengkap yang memiliki label berdasar urutan kepentingan.
Hasilnya dapat digambarkan dalam berbagai cara tergantung pada label yang digunakan.
c. Jelaskan prinsip kerja western blot!
Western blot adalah proses pemindahan protein dari gel hasil elektroforesis ke membran.
Membran ini dapat diperlakukan lebih fleksibel daripada gel sehingga protein yang
terblot pada membran dapat dideteksi dengan cara visual maupun fluoresensi. Deteksi
ekspresi protein pada organisme dilakukan dengan prinsip imunologi menggunakan
antibodi primer dan antibodi sekunder. Setelah pemberian antibodi sekunder, deteksi
dilakukan secara visual dengan pemberian kromogen atau secara fluoresensi. Pada
deteksi secara fluoresensi, reaksi antara antibodi primer dengan antibodi sekunder akan
memberikan hasil fluoresens yang selanjutnya akan membakar film X-ray, deteksi ini
dilakukan di kamar gelap. Merupakan teknik untuk mendeteksi protein spesifik pada
sampel jaringan yang homogenat ataupun dari suatu ekstraksi berdasarkan kemampuan
protein tersebut berikatan dengan antibodi.Teknik ini menggunakan gel elektroforesis
untuk memisahkan protein berdasarkan panjang polipeptida atau berdasarkan struktur
3D-nya.
Perbedaan
Molekul yang di deteksi : SB (DNA),NB (Protein),WB(RNA).
Metode Boltting
: SB (Transfer Capillary),NB (Transfer Electric),WB (Transfer
Capilarry).
Probes : SB (DNA Radioactive), NB(antibodi primer), WB(cDNA, cRNA Radioactive.
Persamaan
Metode yang digunakan SB,NB,WB sama yaitu,Hibridisasi.
PCR
1.Apa kepanjangan dari PCR? Dan jelaskan pengertiannya!
PCR atau Polymerase Chain Reaction adalah metode untuk amplifikasi (memperbanyak)
potongan DNA secara in vitro pada daerah spesfik yang dibatasi oleh dua buah primer
oligonukleotida. Teknik ini mampu memperbanyak sebuah urutan 105-106 kali lipat dari
jumlah nanogram dari DNA template. Proses ini mirip dengan proses replikasi DNA
secara in vivo yang bersifat semi konservatif. PCR ini dapat digunakan untuk amplifikasi
urutan nukleotida, menentukan kondisi urutan nukleotida suatu DNA yang mengalami
mutasi, pada bidang kedokteran forensik dan melacak asal-usul seseorang dengan
membandingkan “finger print”.
2. Macam-macam PCR,dan apa perbedaannya!
a. Real-Time PCR
Real-Time PCR adalah suatu metode analisa yang dikembangkan dari reaksi PCR. Real
time ini juga dikenal sebagai quantitative real time polymerase chain reaction atau
Q-PCR. Teknik ini dapat digunakan untuk mengamplifikasi sekaligus menghitung jumlah
target molekul DNA hasil amplifikasi tersebut. Pada analisa PCR konvensional, deteksi
keberadaan DNA dilakukan pada akhir reaksi dan pengamatan masih harus dilakukan
dengan elektroforesis, namun analisa menggunakan Real-Time PCR memungkinkan
untuk dilakukan pengamatan pada saat reaksi berlangsung sehingga tidak perlu dilakukan
elektroforesis.
b. Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR)
RT-PCR merupakan modifikasi dari PCR, dimana metode ini digunakan untuk
mengamplifikasi RNA, berbeda dengan PCR biasa yang mengamplifikasi DNA. Proses
RT-PCR dibantu oleh enzim Reverse Transcriptase, karena hanya enzim jenis ini yang
dapat mensintesis DNA dengan cetakan RNA, sedangkan polimerase DNA hanya dapat
mensintesis dengan menggunakan cetakan DNA. RT-PCR penting digunakan sebagai alat
diagnostik untuk mendeteksi dan menentukan serotipe virus, sebagai informasi untuk
studi epidemiologi.
c. Nested PCR
Nested PCR adalah suatu teknik perbanyakan (replikasi) sampel DNA menggunakan
bantuan enzim DNA polimerase yang menggunakan dua pasang primer untuk
mengamplifikasi fragmen. Dengan menggunakan nested PCR, jika ada fragmen yang
salah diamplifikasi maka kemungkinan bagian tersebut diamplifikasi untuk kedua kalinya
oleh primer yang kedua. Dengan demikian, nested PCR adalah PCR yang sangat spesifik
dalam melakukan amplifikasi. Waktu yang diperlukan dalam reaksi nested PCR lebih
lama daripada PCR biasa karena pada nested PCR dilakukan 2 kali reaksi PCR,
sedangkan pada PCR biasa hanya 1 kali reaksi PCR.
d. Multiplex PCR
Multiplex PCR merupakan beberapa set primer dalam campuranPCR tunggal yang
menghasilkan amplikon dari berbagai ukuran spesifik untuk sekuens DNA yang berbeda.
Dengan penargetan gen, informasi tambahan dapat diperoleh dari tes tunggal yang tidak
akan membutuhkan banyak reagen.
e.PCR Elisa
PCR-ELISA merupakan metode yang digunakan untuk menangkap asam nukleat yang
meniru prinsip dari enzim linked immunosorbant yang terkait. Dimana dalam sebuah
pengujian hibridisasi hasil produk dari PCR akan terdeteksi dengan metode ini. Dengan
metode inilah dapat dilakukanpengukuran sequen internal pada produk PCR. Metode ini
lebih murah dibandingkan metode Real Time PCR.
3. Jelaskan prinsip kerja Real Time PCR
Prinsip kerja Real Time PCR adalah mendeteksi dan menguantifikasi reporter flourosen.
Sinyal flourosen akan meningkat dengan seiring bertambahnya produk PCR dalam reaksi.
Dengan mencatat jumlah emisi flourosen pada tiap siklus, reaksi selama proses
eksponensial dapat dipantau. Peningkatan produk PCR yang signifikan pada fase
eksponensial berhubungan dengan jumlah inisiasi gen target. Makin tinggi tingkat
ekspresi gen target maka deteksi emisi fluorosen makin cepat terjadi.
4. Jelaskan prinsip kerja Reverse Transkriptase PCR!
Prinsip kerja dari RRT-PCR ini hampir sama dengan RT-PCR konvensional yaitu
denaturasi, annealling dan ekstensi. Namun di dalam RRT-PCR perjalanan reaksi dilihat
per satuan waktu (siklus) dalam RRT-PCR digunakan probe (penanda) yang menempel
pada cetakan DNA, dimana dalam probe tersebut dilengkapi dengan reporter (pembawa
sinyal) dan quencher (penahan sinyal). Jika primer memulai ekstensi DNA, selanjutnya
ekstensi DNA yang diperantarai oleh enzim polymerase akan menghantam probe DNA
menyebabkan lepasnya ikatan reporter dan quencher. Terlepasnya ikatan ini
mengakibatkan terbacanya emisi sinyal reporter oleh perangkat filter dalam mesin Real
Time PCR dalam bentuk sebuah grafik penambahan kopi DNA per satuan siklus PCR.
5. Jelaskan prinsip kerja ELISA!
ELISA (Enzime-Linked Immunosorbent Assay) merupakan salah satu metode yang
sering digunakan untuk deteksi diagnosis. Prinsip kerjanya yaitu penempelan antibody
primer pada bagian tertentu dari molekul target, maka molekul itu akan diisolasi menjadi
murni. Kemudian digunakan untuk mendeteksi target itu. Campuran berbagai antibodi
yang dihasilkan yang terdapat pada serum (antiserum) dari hewan yang diinokulasi
membuat sejumlah antibodi yang berbeda-beda yang masing-masing menempel pada
bagian tertentu dari molekul target (epitop).
Prinsip kerja ELISA tak langsung meliputi langkah-langkah yaitu menempelkan sampel
yang diuji yang diduga mengandung molekul target atau organisme target pada suatu
tempat. Selanjutnya menambahkan antibody primer yang mengenali molekul target dalam
sampel lalu dicuci untuk menghilangkan antibody primer yang tidak berikatan dengan
molekul target. Menambahkan antibodi sekunder yang hanya menempel pada antibody
primer dan tidak menempel pada molekul target. Yang terakhir adalah menambahkan
subtrat tak berwarna.