terhadap viabilitas galur sel kanker prostat

EVALUASI PENGARUH SENG (ZN) TERHADAP
VIABILITAS GALUR SEL KANKER PROSTAT (PC-3)
DENGAN MENGGUNAKAN UJI PROLIFERASI SEL
(METODE MTS)
Muhamad Khaerulloh
Departemen Biologi, FMIPA UI, Kampus UI Depok 16424
[email protected]
Abstrak
Seng (Zn) diketahui dapat menginduksi apoptosis terhadap galur sel kanker
prostat (PC-3). Akumulasi selular Seng (Zn) memiliki efek langsung pada
mitokondria yang menghasilkan pelepasan sitokrom c yang memicu apoptosis.
Tujuan dari penelitian ialah mengevaluasi pengaruh Seng (Zn) terhadap viabilitas
PC-3 dengan konsentrasi 10 µM, 15 µM, 20 µM, dan staurosporin sebagai kontrol
pada waktu pemajanan 0, 6, dan 24 jam. Viabilitas sel-sel tersebut diukur dengan
uji MTS. Hasil uji Kruskal Wallis menunjukkan bahwa tidak terdapat perbedaan
bermakna antara kelompok kontrol dan ketiga kelompok perlakuan. Namun,
terdapat perbedaan bermakna antara perlakuan stauropsorin dibandingkan kontrol
tanpa perlakuan. Dengan demikian, konsentrasi Zn 10 µM, 15 µM, dan 20 µM
pada pemaparan 0 jam, 6 jam, dan 24 jam belum dapat menurunkan viabilitas sel
kanker prostat PC-3 secara signifikan.
Abstract
Zinc (Zn), known to trigger apoptosis in prostate cancer line (PC-3), has direct effect on
mitochondria and the release of cytochrome c leading to apoptosis. The aim of this study was to
evaluate the role of Zinc in Prostate cancer cell line (PC-3) viability with concentrations of 10, 15,
20 µM, and staurosporine as a control, and exposure time of 0, 6, and 24 hours. The cell viability
was assessed with MTS assay. There were no significant differences between control and
treatment groups based on Kruskal Wallis test. However, there was significant difference between
stauroporine treatment and negative control. In conclusion, Zinc (Zn) concentration of 10, 15, 20
µM and exposure time of 0, 6, and 24 hours were not sufficient to decrease significantly the
viability of prostate cancer lines (PC-3).
Keywords: cell viability, MTS assay, PC-3, prostate cancer, zinc
1. PENDAHULUAN
Insiden kanker prostat telah meningkat hampir di seluruh dunia, dengan lebih dari
670.000 orang terdiagnosis setiap tahunnya. Angka tersebut merupakan 28% dari
1
Universitas Indonesia
Evaluasi pengaruh..., Muhamad Khaerulloh, FMIPA, 2014
2
seluruh kejadian kanker yang terjadi pada pria (NCCC 2008: 37). Berdasarkan
data dari Indonesian Society of Onkologi, terdapat 490 pasien (50,5%) yang
terdiagnosis mengidap kanker prostat dari 971 pasien yang menjalani pemeriksaan
urologik, serta menjadi penyebab terbesar kedua dari kematian terkait kanker yang
terjadi pada pria setelah kanker paru-paru (Safriadi 2013: 76).
Sel prostat mempunyai karakteristik yang unik, yaitu mampu mengakumulasi
seng (Zn) hingga mencapai konsentrasi tinggi, yang dapat bersifat racun untuk sel
lain (Franklin & Costello 2009: 4; Fong & Sazaly 2011: 1). Akumulasi
konsentrasi Zn pada sel tersebut 10 kali lebih tinggi dibandingkan dengan sel dari
jaringan lunak lainnya (Gonzalez dkk. 2009: 1). Namun, ketika sel prostat
menjadi sel kanker, kemampuannya untuk mengakumulasi Zn secara intraseluler
berkurang. Alasan utama dari hal tersebut masih belum diketahui secara pasti.
Namun demikian, kenyataan menunjukkan bahwa konsentrasi seng (Zn) pada sel
kanker prostat lebih rendah dibandingkan dengan sel prostat normal dan jaringan
benign prostate hyperplasia (BPH) (Gonzalez dkk. 2009: 1; Franklin & Costello
2009: 4; Fong & Sazaly 2011: 1).
Salah satu cara untuk mengatasi kanker prostat ialah memberikan Zn konsentrasi
tinggi pada sel tersebut. Cara tersebut terbukti dapat menghambat proliferasi dan
invasi sel kanker prostat (Fong & Sazaly 2011: 1). Feng dkk. (2008 : 2)
melakukan penelitian terhadap galur sel kanker prostat (PC-3) yang diperlakukan
dengan Zn. Seng (Zn) diketahui memfasilitasi pembentukan pori oleh protein Bax
yang kemudian memulai apoptogenesis jalur mitokondria. Pori tersebut
membantu pelepasan sitokrom c dari mitokondria, yang akan memicu apoptosis
melalui jalur caspase (Feng dkk. 2008 : 2).
Penelitian lain telah membuktikan bahwa protein pro-apoptotik Bax secara
langsung berinteraksi dengan kanal ion VDAC (Voltage-dependent Anion
Channel) yang terdapat pada membran mitokondria kemudian menginduksi
keluarnya sitokrom c dari dalam mitokondria ke sitoplasma dan selanjutnya dapat
memicu proses apoptosis (Rostovseva dkk. 2005:2). Berdasarkan hal tersebut,
pemberian Zn pada sel kanker prostat diduga juga berpengaruh pada protein
VDAC.
Universitas Indonesia
Evaluasi pengaruh..., Muhamad Khaerulloh, FMIPA, 2014
3
Tim peneliti Departemen Biologi FKUI melakukan penelitian untuk mengevaluasi
ekspresi protein keluarga Bcl-2 dan protein kanal ion VDAC1 (Voltage-dependent
Anion Channel 1) pada galur sel kanker prostat (PC-3) yang diinduksi
apoptosisnya dengan Zn. Sebagai langkah awal penelitian tersebut, perlu
diketahui terlebih dahulu berapa konsentrasi Zn yang optimal untuk dapat memicu
terjadinya apoptosis pada galur sel PC-3. Sebelumnya, Feng dkk. (2008: 2) telah
melakukan penelitian tentang mekanisme apoptosis pada galur sel kanker prostat
(PC-3) yang diinduksi Zn dan hasil penelitian menunjukkan bahwa keadaan yang
optimal yang didapat ialah pada konsentrasi Zn 15 µM dengan waktu pemajanan
enam jam. Namun, karena kondisi galur sel, lingkungan uji, dan subkultur yang
berbeda dengan Feng dkk., maka perlu dilakukan evaluasi konsentrasi Zn dan
waktu pemajanan yang optimal untuk dapat menginduksi apoptosis pada galur sel
kanker prostat (PC-3).
Pemberian Zn pada galur sel PC-3 akan menghambat proliferasi dan memicu
kematian sel yang terprogam (apoptosis). Terhambatnya proliferasi dan
terjadinya apoptosis akan berdampak terhadap penurunan viabilitas sel. Oleh
karena itu, viabilitas sel-sel tersebut dapat dihitung menggunakan Method Of
Detection Of Thetetrazolium Salt, salah satunya dengan uji proliferasi sel (MTS)
dengan nama kimia larutan tersebut ialah [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium]. Uji MTS merupakan
salah satu metode pengujian terhadap viabilitas sel melalui pengukuran aktivitas
metaboliknya (Riss dkk. 2004: 5, Huang dkk. 2004: 406).
Penelitian bertujuan untuk mengevaluasi pengaruh berbagai konsentrasi Zn (10
µM, 15 µM, dan 20 µM) dengan waktu pemajanan (0 jam, 6 jam, dan 24 jam)
terhadap viabilitas galur sel kanker prostat (PC-3). PC-3 tersebut berasal dari stok
kultur LAPTIAB (Laboratorium Pengembangan Teknologi Industri dan
Biomedika) BPPT pada passage ke-34. Mengacu pada hasil penelitian Feng
dkk.(2008), viabilitas terendah galur sel PC-3 stok LAPTIAB (Laboratorium
Pengembangan Teknologi Industri dan Biomedika) BPPT pada konsentrasi 15 µM
dan waktu pemajanan 6 jam. Hasil penelitian akan digunakan untuk penelitian
selanjutnya tentang ―Evaluasi ekspresi VDAC1 dan protein keluarga Bcl-2 pada
Universitas Indonesia
Evaluasi pengaruh..., Muhamad Khaerulloh, FMIPA, 2014
4
galur sel kanker prostat yang diinduksi apoptosisnya oleh Zn sebagai studi
molekular karsinogenesis prostat‖.
Universitas Indonesia
Evaluasi pengaruh..., Muhamad Khaerulloh, FMIPA, 2014
5
2. TINJAUAN TEORITIS
2.1 Pengaruh Seng (Zn) terhadap Kanker Prostat
Seng (Zn) merupakan elemen penting dengan sifat antioksidan yang
terlibat dalam berbagai fungsi sel, termasuk perbaikan DNA dan apoptosis. Zn
juga membantu dalam pemeliharaan sistem kekebalan tubuh. Namun, Zn juga
dapat bersifat racun untuk jaringan tertentu jika konsentrasi Zn dalam keadaan
yang tinggi (Costello & Franklin 2006: 9).
Konsentrasi Zn dalam jaringan prostat lebih tinggi dibandingkan dalam
jaringan lain pada tubuh. Namun, konsentrasi Zn pada kanker prostat lebih
rendah dibandingkan dengan prostat yang normal, karena sel-sel kanker telah
kehilangan kemampuannya untuk mengakumulasi Zn dalam jumlah yang besar
(Epstein dkk. 2011: 586). Mekanisme yang bertanggung jawab untuk
metabolisme transformasi ini adalah penurunan regulasi hZIP1, yang merupakan
transporter utama yang bertanggung jawab untuk penyerapan dan akumulasi Zn
dalam sel prostat (Costello & Franklin 2006: 9).
Seng (Zn) telah diketahui dapat menginduksi apoptosis dalam berbagai
jenis sel mamalia, termasuk sel-sel epitel prostat, neuron dan sel glial, sel epitel
ovarium, sel epitel esofagus, sel koriokarsinoma, sel hepatoma, dan lain-lain.
Sebaliknya, dalam sel-sel lain misalnya sel payudara, sel epitel paru-paru, sel-sel
ginjal, makrofag, limfosit, sel-sel asinar pankreas, sel Hela dan lain-lain, Zn
menunjukkan efek anti-apoptosis (Frangklin & Costello 2009: 3).
Studi ekperimental Zn umumnya melibatkan manipulasi pada
tingkat sel. Zn merupakan unsur penting dalam penetuan dan pengaturan terhadap
proses apoptosis pada sel mamalia. Zn dapat mengiduksi apoptosis melalui
beberapa jalur. Mekanisme apoptosis yang diinduksi oleh Zn dapat dilihat pada
gambar 2.2.3. Gambar tersebut menunjukkan bahwa Zn dapat menginduksi
apoptosis secara langsung maupun secara tidak langsung. Mekanisme yang
mengarah langsung pada inti sel atau mengarah langsung pada jalur apoptogensis
mitokondria ditunjukkan pada A dan B. Zn juga dapat mengatur atau memodulasi
sebagai sinyal yang akan mengaktifkan faktor/jalur terjadinya apoptosis pada sel
Universitas Indonesia
Evaluasi pengaruh..., Muhamad Khaerulloh, FMIPA, 2014
6
yang kemudian akan bertindak langsung pada inti sel atau apoptogenesis
mitokondria (C), sedangkan jalur (D) menjelaskan bahwa mitokondria yang telah
mengalami perubahan fungi akan memicu langsung proses apoptosis pada inti sel.
Selain itu, Zn memiliki efek langsung pada mitokondria (B) yang akan
menginduksi perubahan fungsi mitokondria, yang menghasilkan kondisi (E1) dan
mengaktifkan jalur sinyal apoptosis (E2) (Frangklin & Costello 2009: 3).
Gambar 2.2.3. (1) Representasi dari beberapa jalur Seng (Zn) sebagai
penginduksi apoptosis.
[Sumber: Frangklin & Costello 2009: 13]
Pemberian Zn dapat menurunkan viabilitas galur sel PC-3. Viabilitas sel
yang menurun disebabkan karena adanya peristiwa apoptosis pada sel tersebut.
Apoptosis terjadi karena adanya peran Zn sebagai penginduksinya. Zn
menunjukkan efek langsung pada mitokondria dan memfasilitasi penyisipan
protein Bax pada membran mitokondria (Gambar 2.3.3 (2)). Selain itu Zn juga
memengaruhi faktor trasnkripsi pada inti sel untuk mengekspresikan protein Bax
lebih banyak. Protein Bax akan menyisip pada membran mitokondria dan
membentuk pori yang akan menjadi jalan keluar bagi sitokrom c. Ketika
sitokrom c keluar akan memicu protein caspase untuk menginduksi terjadinya
apoptosis (Feng dkk. 2008: 4).
Universitas Indonesia
Evaluasi pengaruh..., Muhamad Khaerulloh, FMIPA, 2014
7
Keterangan:
OM : Membran luar
IM : Membran dalam
Mito : Mitokondria
TF : Transcription Factor
Zn : Seng (Zn)
Gambar 2.3.3. (2) Skema terjadinya apoptosis yang diinduksi oleh Seng
(Zn).
[Sumber : Feng dkk. 2008: 4]
2.2
Staurosporin
Staurosporin merupakan senyawa kimia yang diisolasi dari Streptomyces
sp.. Staurosporine telah lama digunakan secara in vitro sebagai inisiator apoptosis
dalam berbagai jenis sel yang berbeda (Zhang 2004: 1). Staurosporin banyak
digunakan sebagai protein kinase C dan memiliki efek beragam pada sel,
termasuk sebagai induksi diferensiasi sel dan induksi apoptosis. Senyawa ini
memiliki efek sitotoksik dan antiproliferatif yang sangat signifikan (Prade
dkk.1997: 1627; Chae H.J. dkk 2000: 1).
Universitas Indonesia
Evaluasi pengaruh..., Muhamad Khaerulloh, FMIPA, 2014
8
Beberapa studi, staurosporin ditemukan memiliki aktivitas biologis yang
dapat menghambat invasi sel tumor dan menginduksi apoptosis pada beberapa
jenis sel (Yue dkk 1998: 496; Chae dkk 2000: 373). Staurosporin sebagai pemicu
apoptosis lebih praktis digunakan pada penelitian karena semua protein yang
dibutuhkan dalam jalur apoptosis sudah tersedia di dalam sel target, sehingga
tidak perlu menginduksi protein lain dari luar sel. Sudah banyak mekanisme
penting yang terlibat dalam proses apoptosis telah dibuktikan dalam
staurosporine-induksi apoptosis (Yue dkk 1998: 496).
2.3
Pengujian Viabilitas dengan Uji MTS
Uji MTS (MTS assay) merupakan salah satu pengujian terhadap
proliferasi melalui pengukuran viabiltas sel dengan melihat dari aktivitas
metaboliknya. Prinsip pengujian MTS yamg hampir sama dengan MTT, yaitu
dengan pengukuran secara tidak langsung terhadap produk senyawa berwarna
yang dihasilkan oleh reaksi reagen dengan sel viabel. MTS merupakan komponen
tetrazolium [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxylmethoxphenyl)-2-(4sulfophenyl)-2H-tetrazolium, bentuk garam (MTS)] yang biasanya
dikombinasikan dengan electron coupling, misalanya PES (phenazin ethosulfate).
Komponen tetrazolium MTS direduksi oleh sel membentuk produk formazen
berwarna yang larut dalam medium kultur (Gambar 2.5) Jumlah produk
formazen diukur serapannya pada panjang gelombang 490 nm, serapan yang
dihasilkan ini setara dengan jumlah sel viabel pada kultur (Riss dkk. 2004: 5,
Huang dkk. 2004: 406).
Universitas Indonesia
Evaluasi pengaruh..., Muhamad Khaerulloh, FMIPA, 2014
9
Gambar 2.5. Struktur MTS yang direduksi membentuk Formazan
[Sumber: Promega 2009: 3]
Pengujian dengan menggunakan MTS merupakan pengembangan lebih
lanjut dari MTT. Pengujian MTS dianggap lebih mudah dibandingkan dengan
MTT karena membutuhkan langkah yang lebih sedikit. Formazen ungu yang
terbentuk akibat reduksi senyawa MTS dapat larut dalam medium, sehingga
langkah pelarutan dalam pengujian MTT dapat dihilangkan. Selain itu, pengujian
ini memiliki pengerjaan yang sederhana karena tidak memerlukan langkah
pemanenan sel atau pencucian sel (Riss dkk. 2004: 5, Huang dkk. 2004: 406).
3. METODE PENELITIAN
3.1 Lokasi dan waktu penelitian
Penelitian dilakukan di Laboratorium Kultur Sel Departemen Biologi
Kedokteran, Fakultas Kedokteran UI. Penelitian dimulai pada bulan Juni 2013
sampai bulan November 2013.
3.2
Alat, Bahan, dan Cara kerja
3.2.1
Alat
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ialah laminar air flow [Jouan
MSC 12], waterbath incubator [Yamato], inkubator CO2 [Binder], autoclave [,
adjustable pipettor (2—20 µl, 20—20 µl, dan 100—1000 µl) [Bio-Rad, Gilson],
pipet serologis steril (5 ml, 10 ml, dan 25 ml) [Corning], tabung sentrifuge (15 ml
dan 50 ml) [Corning], rak tabung, mesin sentifugasi [Human], tabung kriogenik 2
ml [Nunc], flask kultur (T-25 dan T-75) [Corning], mikroskop inverted [Nikon],
Universitas Indonesia
Evaluasi pengaruh..., Muhamad Khaerulloh, FMIPA, 2014
10
96 wells plate [Iwaki], vacuum pump, tips steril [Axygen Scientific], mesin
vortex, ELISA reader [Multiskan GO], botol medium steril (100 ml, 200 ml, dan
500 ml), gelas ukur 500 ml; tabung Erlenmeyer 500 ml, syringe filter 0,2 μm
[Gelman], labu takar 500 ml dan vacuum filter.
3.2.2
Bahan
3.2.2.1 Bahan Uji
Bahan uji yang digunakan ialah Seng (Zn) yang berasal dari
senyawa Zinc Sulfate Heptahydrate yang diproduksi oleh Sigma-Aldrich
(no.catalog Z0251-100G) dan sebagai kontrol positifnya digunakan staurosporin
yang diproduksi oleh ABCAM (no.catalog ab120056).
3.2.2.2 Sel Uji
Sel uji yang digunakan dalam penelitian ialah cell line yang diperoleh dari
stok LAPTIAB (Laboratorium Pengembangan Teknologi Industri dan Biomedika)
BPPT pada passage ke-34.
3.2.2.3 Medium
Medium yang digunakan dalam penelitian ialah 1X RPMI 1640
mengandung 2mM L-Glutamine [MP] dan disuplementasi 10% (v/v) Fetal Bovine
Serum/FBS [GIBCO], 1% (v/v) penicillin-streptomycin [MP]. Medium berikut
dinamakan medium lengkap RPMI 1640 – 10% FBS – 1% penicillinstreptomycin.
3.2.2.4 Bahan Lain yang Digunakan
Bahan lain yang digunakan ialah dimetil sulfoksida (DMSO), TripsinEDTA [Sigma], asam klorida (HCl) 1 N, trypan blue [Sigma], fungizone,
akuabides, natrium bikarbonat (NaHCO3), MTS [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium] [Promega].
Universitas Indonesia
Evaluasi pengaruh..., Muhamad Khaerulloh, FMIPA, 2014
11
3.3 Cara kerja
Perhitungan sel
Inkubasi bagi yang 6
dan 24 jam.
0Jam melakukan uji
MTS
Tanam sel sebanyak
20.000 µl sel (20.000
sel)
Tambahkan 80 µl
medium lengkap
Inkubasi 24 jam
Ambil perlahan 10 µl
medium fasting dan
tambahkan 10 µl
zinc yang sesuai
Inkubasi 24 jam
Ganti medium
lengkap dengan 100
µl medium fasting
Berdasarkan perhitungan sel, suspensi yang mengandung sel diambil sebanyak 20
µl (20.000 sel) lalu dimasukkan ke dalam well pada ketiga plate (0 jam, 6 jam dan
24 jam) (lampiran 1). Medium complete ditambahkan sebanyak 80 µl pada well
yang berisi sel dan 100 µl pada well blangko. Ketiga plate disimpan di dalam
inkubator (37 oC dan 5% CO2) selama 24 jam.
Setelah 24 jam, semua medium yang berisi sel diganti dengan 100 µl
medium fasting kecuali pada blanko. Plate disimpan kembali di dalam inkubator
(37 oC dan 5% CO2) selama 24 jam. Setelah 24 jam berikutnya, medium berisi sel
diambil perlahan mediumnya sebanyak 10 µl dan ditambahkan 10 µl medium
dengan konsentrasi Seng (Zn) dan 10 µl dengan staurosporin pada masing-masing
well yang telah ditentukan (lampiran 1). Plate 6 jam dan 24 jam disimpan kembali
ke dalam inkubator (37 oC dan 5% CO2). Uji MTS dilakukan pada plate 0 jam
dengan menambahkan 20 µl larutan MTS. Selanjutnya plate disimpan kembali
pada inkubator 37 oC dan 5% CO2 selama 1 jam. Setalah 1 jam, plate dikeluarkan
dan di masukkan ke dalam ELISA reader untuk menghitung nilai absorbansinya
dengan panjang gelombang 490nm. Hal yang sama dilakukan pada plate 6 jam
dan plate 24 jam sesuai waktunya masing-masing.
3.4
Analisis Data
Data yang akan diperoleh adalah nilai absorbansi uji MTS dengan panjang
gelombang 490 nm pada blangko, staurosporin ,dan konsentrasi Zn 0 µM, 100
Universitas Indonesia
Evaluasi pengaruh..., Muhamad Khaerulloh, FMIPA, 2014
12
µM, 150 µM, dan 200 µM. Masing-masing pengukuran dilakukan dengan waktu
pemajanan pada 0 jam, 6 jam, dan 24 jam. Nilai absorbansi di uji normalitasnya
dengan uji normalitas Shapiro-Wilk. Anova dengan alternatif Kruskal-Wallis
digunakan untuk mengetahui perbedaan antara kelompok signifikan atau tidak
(α<0.05). Selain itu, dilakukan perhitungan persentase viabilitas dengan
menggunakan nilai absorbansi yang didapat tiap kelompok (CCRC 2009: 5).
% 𝑉𝑖𝑎𝑏𝑖𝑙𝑖𝑡𝑎𝑠 𝑠𝑒𝑙 =
𝐴𝑏𝑠. 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙 − 𝐴𝑏𝑠. 𝑘𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 𝑚𝑒𝑑𝑖𝑎
× 100%
𝐴𝑏𝑠. 𝑘𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 𝑠𝑒𝑙 − 𝐴𝑏𝑠. 𝑘𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 𝑚𝑒𝑑𝑖𝑎
Universitas Indonesia
Evaluasi pengaruh..., Muhamad Khaerulloh, FMIPA, 2014
13
4
HASIL PENELITIAN
Sebanyak 135 dari 180 sampel diikutsertakan dalam analisis statistik. Empat puluh
lima sampel tidak dapat diikutkan dalam analisis karena viabilitas bernilai negatif. Hal
tersebut dapat disebabkan karena adanya kontaminasi pada kultur sel yang diujikan.
Deskripsi data dapat dilihat pada tabel 4.3.1.
Tabel 4. Deskripsi Data Viabilitas
Waktu
0 Jam
6 Jam
24 Jam
Konsentrasi
0 µM
10 µM
15 µM
20 µM
Staurosporin
0 µM
10 µM
15 µM
20 µM
Staurosporin
0 µM
10 µM
15 µM
20 µM
Staurosporin
N
8
8
8
8
8
10
10
10
10
10
9
9
9
9
9
Mean (%)
97,17
89,84
97,55
105,52
51,46
98,53
113,35
111,48
115,42
35,68
97,18
105,79
104,74
101,17
9,73
Maksimum (%)
105,61
133,95
109,46
121,37
68,3
115,54
181,52
167,65
171,11
101,74
126,72
136,73
139,66
141,9
37,15
Minimum (%)
88,11
48,82
84,51
90,97
38,86
76,92
35,51
92,78
95,03
0
75,93
79,83
80
80,2
0
Data dibagi menjadi 3 kelompok berdasarkan waktu, kemudian dibagi menjadi 3 taraf
berdasarkan konsentrasi. Distribusi data dilakukan dengan menggunakan uji Shapiro Wilk.
Diketahui bahwa data tidak terdistribusi secara normal meskipun telah ditransformasi dengan
fungsi logaritma berbasis 10. Dengan demikian, uji yang digunakan untuk mengetahui
pengaruh Seng (Zn) antara kelompok uji ialah uji Kruskal Wallis.
Berdasarkan uji Kruskal Wallis, tidak ditemukan perbedaan rerata yang signifikan
antara konsentrasi pada kelompok waktu 0 jam, 6 jam, dan 24 jam, dengan nilai p, yaitu 0,34,
0,41, dan 0,58, berturut-turut. Namun, ditemukan perbedaan yang signifikan jika
dibandingkan dengan staurosporin sebagai kontrol positifnya pada kelompok waktu 0 jam, 6
jam, dan 24 jam, dengan nilai p < 0,01. Visualisasi data pada Gambar 4.3.2 (1) mempertegas
sebaran data yang hampir sama diantara taraf konsentrasi dalam semua kelompok waktu.
Dokumentasi mikroskopis memperlihatkan bahwa kepadatan sel pada masing masing
13
Evaluasi pengaruh..., Muhamad Khaerulloh, FMIPA, 2014
14
perlakukan tidak berbeda jauh, kecuali pada staurosporin. Hasil dapat dilihat dari kerapatan
sel yang masih hidup membentuk monolayer, sedangkan sel yang mati tampak pecah dan
mengambang.
A
Staurosporin
Staurosporin
Staurosporin
B
0,04µm
400X
400X
400X
0,04µm
0,04µm
400X
400X
0,04µm
0,04µm
Gambar 4. (1) (A) Diagram boxplot perbandingan konsentrasi berdasarkan waktu, (B)
Pengamatan mikroskopis pada jam ke-6.
14
Evaluasi pengaruh..., Muhamad Khaerulloh, FMIPA, 2014
15
Hasil yang sama juga diperoleh dari uji Kruskal Wallis berdasarkan waktu.
Berdasarkan uji tersebut, tidak ditemukan perubahan yang signifikan pada semua konsentrasi
selama waktu pemajahan, kecuali pada staurosporin sebagai kontrol positifnya. Nilai p pada
kelompok 10 µM, 15 µM, 20 µM, dan staurosporin secara berturut-turut ialah 0,22, 0,28,
0,44, dan 0,0006. Hasil visualisasi gambar 4.3.2 (2) memperlihatkan tidak terjadi penurunan
yang sesuai dengan studi terdahulu (Feng 2000: 32). Staurosporin memiliki efek apoptosis
yang berbeda dengan perlakuan Zn dimungkinkan staurosporin dapat memicu terekspresinya
protein proapoptosis secara berlebihan (overexpression) yang akan menginduksi terjadinya
apoptosis secara cepat, serta staurosporin menginduksi apoptosis melalui dua mekanisme,
yaitu secara caspase-dependent dan caspase-independent (Belmokhtar dkk.2001: 3354;
Zhang dkk. 2014: 189).
Gambar 4\ (2) Visualisasi data viabilitas sel pada waktu pemajanan berdasarkan konsentrasi
Seng (Zn)
Seng (Zn) diketahui berperan penting dalam mekanisme apotosis sel kanker prostat
(Feng dkk 2008: 1). Namun, hasil penelitian menunjukkan hasil yang berbeda. Hal tersebut
kemungkinan karena kadar Seng (Zn) yang digunakan dalam penelitian kurang tinggi.
Penelitian yang dilakukan Iguchi dkk. (1998: 768), menunjukkan bahwa viabilitas sel PC-3
mulai mengalami penurunan pada konsentrasi Zn 100 µM, sedangkan pada konsentrasi Zn 50
µM tidak ditemukan penurunan viabilitas yang signifikan.
15
Evaluasi pengaruh..., Muhamad Khaerulloh, FMIPA, 2014
16
Seng (Zn) masuk ke dalam sel dari matriks ekstraseluler melalui suatu protein
membran yang dikenal sebagai ZIP1. Diketahui berdasarkan laporan Franklin dkk. (2003:
435), penurunan ekspresi ZIP1 berbanding lurus dengan penurunan konsentrasi Seng (Zn) di
sitosol. Proses subkultur dan kenaikan nomor passage pada galur sel Caco-2 diketahui
berhubungan dengan penurunan protein transporter pada membran (Behrens dkk. 2004:
1743). Diduga hal yang serupa terjadi pada ZIP1 galur sel PC-3, sehingga diperlukan
konsentrasi Seng (Zn) yang lebih tinggi untuk memicu peristiwa apoptosis.
Laporan dari Pronsato dkk. (2013: 4) menyatakan bahwa galur sel otot C2C12 tanpa
perlakuan apapun dapat mengalami penurunan jumlah salinan mtDNA dan respon protein Bax
bersamaan dengan kenaikan nomor passage. Seng (Zn), sebagai pemicu apoptosis,
menunjukkan efek langsung pada mitokondria dan memfasilitasi penyisipan protein Bax pada
membran mitokondria. Selain itu Seng (Zn) juga memengaruhi faktor trasnkripsi pada inti sel
untuk meningkatkan ekspresi protein Bax. Protein Bax akan menyisip pada membran
mitokondria dan membentuk pori yang akan menjadi jalan keluar bagi sitokrom c. Ketika
sitokrom c keluar akan memicu protein caspase untuk menginduksi terjadinya apoptosis
(Feng dkk. 2008: 4).
Berdasarkan hasil dari penelitian, dapat disimpulkan bahwa tidak terdapat perbedaan
viabilitas yang signifikan antar kelompok uji, sehingga tidak dapat ditentukan konsentrasi
Seng (Zn) yang paling efektif untuk menyebabkan apoptosis galur PC-3. Diduga terdapat
pengaruh faktor lain dalam penelitian, seperti nomor passage. Pengaruh nomor passage
terhadap karakteristik galur sel, terutama sel PC-3, belum dipelajari secara jelas. Meskipun
pada beberapa studi pada galur sel lain telah dijelaskan pengaruh tersebut, namun masih
diperlukan penelitian lebih lanjut khusus pada galur sel PC-3. Nomor passage pun harus
dicantumkan dalam setiap studi yang melibatkan kultur sel. Hal tersebut menjadi penting
untuk menghindari variabel pengganggu selama penelitian.
5
KESIMPULAN
Tidak terdapat perbedaan yang signifikan pada viabilitas sel PC-3 di antara konsentrasi
Seng (Zn) 10, 15, dan 20 µM dan waktu pemajaan 0, 6, dan 24 jam.
16
Evaluasi pengaruh..., Muhamad Khaerulloh, FMIPA, 2014
17
DAFTAR REFERENSI
ACS (=American Cancer Society). 2012. Prostate cancer. American Cancer Society, USA:
85 hlm.
ATCC (=American Type Culture Collection). 2012. Thawing, Propagating, and
Cryopreserving Protocol Prostate Adenocarcinoma (PC-3). American Type Culture
Collection, USA: 24 hlm.
ATCC (=American Type Culture Collection). 2013. CRL-1435: 1 hlm.
http://www.atcc.org/en/Global/Products/3/C/9/9/CRL-1435.aspx. 15 November 2013,
pk 14.00
Belmokhtar, C.A., J. Hillion, & E. S. Bendirdjian. 2001. Staurosporine induces apoptosis
through both caspase-dependent and caspase-independent mechanisms. Oncogene 20:
3354—3362.
Behrens, I.., W. Kamm, A. H. Dantzig & T. Kissel. 2004. Variation of peptide transporter
(PepT1 and HPT1) expression in Caco-2 cells as a function of cell origin. Journal of
Pharmaceutical Sciences 93 (7): 1743 –1754.
Butler, K. 2005. Animal cell culture and technology. 2nd ed. Bios Scientific Publisher, New
York: x + 299 hlm.
CCRC (=Cancer Chemoprevention Research Center). 2009. Uji Pengamatan Proliferasi Sel
(Doubling Time). Fakultas Farmasi UGM, Yogyakarta: 5 hlm.
Chae, H.J., J.S. Kang, J.O. Byun, K.S. Han, D.U. Kim, S.M. Oh, H.M. Kim, S.W. Chae, &
H.R. Kim. 2000. Molecular mechanism of staurosporine induced apoptosis in
osteoblasts. Pharmacological Research, 42( 4): 373--381
Corwin, E.J. 2008. Handbook of pathophysiology, 3rd ed., a Wolters Kluwer Business, USA:
xiv + 842 hlm.
Costello, L.C. & Franklin R.B. 2006. The clinical relevance of the metabolism of prostate
cancer; zinc and tumor suppression: connecting the dots. Molecular Cancer 5(17): 1—
13.
Epstein, M.M., J. L. Kasperzyk, O. Andre´n, E. L. Giovannucci, A. Wolk, N. Ha°kansson, S.
Andersson, J. Johansson, K. Fall, & L. A. Mucci. 2011. Dietary zinc and prostate
cancer survival in a Swedish cohort. The American Journal of Clinical Nutrition
93:586--593
17
Evaluasi pengaruh..., Muhamad Khaerulloh, FMIPA, 2014
18
Feng, P., T. Li, Z. Guan, R. B. Franklin, & L. C. Costello. 2008. The involvement of bax in
zinc-induced mitochondrial apoptogenesis in malignant prostate cells. Molecular
Cancer 7(25): 1—6.
Fong,W.P. & A.B.Sazaly. 2011. Zinc supplementation and prostate cancer. Prostate Cancer From Bench to Bedside (19): 423—444.
Franklin R.B., J. Ma, J. Zou, Z. Guan, B.I. Kukoyi1, P. Feng, L.C. Costello. 2003. Human
ZIP1 is a major zinc uptake transporter for the accumulation of zinc in prostate cells.
Journal of Inorganic Biochemistry 96 : 435—442.
Franklin R. B. & L.C. Costello. 2009. The important role of the apoptotic effects of zinc in
the development of cancers. Journal of Cellular Biochemistry 106(5): 750–757.
Freshney, R.I. 2005. Culture of animal cells: A manual of basic technique. 5th ed. John Wiley
& Sons Inc., New York: 580 hlm.
Gadbois, D. M., J. R. Hamaguchi, R. A. Swank & E. M. Bradbury. 1992. Staurosporine is a
potent inhibitor of p34cdc2 and p34cdc2-like kinases. Biochemical and Biophysical
Research Communications 184(1): 80—85
Gonzalez A., U. Peters, J.W.Lampe, & E.White. 2009. Zinc intake from supplements and diet
and prostate cancer. Nutrition and Cancer 61(2) :1—17.
Huang, K.T., Y.H. Chen, & A.M. Walker. 2004. Inaccuracies in MTS assays: major distorting
effects of medium, serum albumin, and fatty acids. BioTechniques 37 : 406—412.
Mather, J.P. & P.E. Robert. 1998. Introduction to cell and tissue culture: Theory and
technique. Plenum Press, New York: xv +239 hlm.
MuraliKrishna, P.S., C. S. Gondi, S. S. Lakka, A. Julta, N. Estes, M. Gujrati, & J. S. Rao.
2005. RNA interference-directed knockdown of urokinase plasminogen activator and
urokinase plasminogen activator receptor inhibits prostate cancer cell invasion, survival
and tumorigenicity In vivo. The Journal of Biological Chemistry 280 (43): 36529—
36540.
NCCC (= National Collaborating Centre for Cancer). 2008. Prostate cancer: Diagnosis and
treatment. NCCC, United Kingdom: xxxiii + 112 hlm.
Prade, L., R. A. Engh, A. Girod, V. Kinzel, R. Huber, & D. Bossemeyer. 1997. Staurosporineinduced conformational changes of cAMP-dependent protein kinase catalytic subunit
explain inhibitory potential. Structure 5:1627–1637
Promega. 2009. CellTiter 96® aqueous non radioactive cell proliferation assay. Promega,
Madison: 16 hlm.
18
Evaluasi pengaruh..., Muhamad Khaerulloh, FMIPA, 2014
19
Pronsato, L., A. L. Colla, A. C. Ronda, L. Milanesi, R. Boland, & A. Vasconsuelo. 2013.
High passage numbers induce resitance to apoptosis in C2C1 muscle cells. Biocell
37(1): 1—6.
Riss, T.L., R.A. Moravec, A.L. Niles, H.A. Benink, T.J. Worzella, & L.Minor. 2004. Cell
viability assays. Assay Guidance Manual : 1—23.
Rostovseva, T.K, T. Wenzhi, & C. Marco. 2005. On the role of VDAC in apoptosis: Fact and
fiction. Journal of Bioenergetics and Biomembranes 37(3): 129—142.
Ryan, J.A. 2008. Introduction to animal cell culture. Corning Technical Bulletin 3(8): 1—8.
Safriadi, F. 2013. Bone metastases and bone loss medical treatment in prostate cancer
patients. Acta Medica Indonesiana - The Indonesian Journal of Internal Medicine
45(1): 76—80.
Santoso, S. 2013. Menguasai SPSS 21 di era informasi. Elex Media Komputindo, Jakarta: x +
343 hlm.
Sinha, B.K. & R. Kumar. 2008. Principles of animal cell culture. International Book
Distributing Co., India: xxii + 282 hlm.
Sumbrook, J.& D.W. Russel. 2001. Molecular cloning: A laboratory manual. Vol. 1. 3rd ed.
Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York: xxvii + 1.1—7.94+1.44 hlm.
Yue T.L., C. Wang, A.M. Romanic, K. Kikly, P. Keller, W. E. DeWolf Jr, T. K. Hart, H. C.
Thomas, B. Storer, J.L. Gu, X. Wang & G. Z. Feuerstein. 1998. Staurosporine induced
Apoptosis in Cardiomyocytes: A Potential Role of Caspase-3. Journal of Molecular
and Cellular Cardiology 30: 495–507
Zhang,J.J., M. Wu, N.W.Schoene, W.H.Cheng, T.T.Y.Wang, A.A.Alshatwi, M.Alsaif, &
K.Y. Lei. 2009. Effect of resveratrol and zinc on intracellular zinc status in normal
human prostate epithelial cells. American Journal of Physiology - Cell Physiology 297:
C632–C644.
Zhang X. D., S. K. Gillespie, & P. Hersey. 2004. Staurosporine induces apoptosis of
melanoma by both caspase-dependent and –independent apoptotic pathways.
Molecular Cancer Therapeutics. 3:187—197.
19
Evaluasi pengaruh..., Muhamad Khaerulloh, FMIPA, 2014