LAMPIRAN

LAMPIRAN
Lampiran 1. Tahapan Penelitian
Kultur Stok S. thermopillus, L. bulgaricus,
dan B. bifidum
MRS agar miring
Peremajaan S. thermopillus, L.
bulgaricus, dan B. bifidum
Uji Konfirmasi Morfologi sel
S. thermopillus, L. bulgaricus,
dan B. bifidum
Pengukuran OD dan Pembuatan Kultur
Starter S. thermopillus, L. bulgaricus,
dan B. bifidum
Pembuatan Yoghurt dengan Starter
S. thermopillus, L. bulgaricus, dan B.
bifidum dengan perbandingan
konsentrasi 1:1:0, 1:1:0.5, 1:1:1, 1:1:1.5
Perhitungan
Jumlah BAL dan
Bakteri
Psikrptrofik
Pengukuran
aktivitas
protease
(metode Lowry)
Pengukuran
kadar asam
laktat (titrasi)
xx
Lampiran 2. Spesifikasi Alat dan Bahan
No
Nama Alat
1
Autoklaf
2
pH meter
3
Shaker Inkubator
4
Mikroskop
UV- Vis
Spektrophotometer
5
Merk/Type
HL36E (Hirayama
Manufacturing Corp.)
Thermo Electron
Corporation (RL060P)
Lab Companion SI600
Olympus CO11
Shimadzu UV mini
1240
Eppendorf Centrifuge
541R
Ika C-Mag HS7
Ep. Research park
Memmert
Kegunaan
Sterilisasi Alat dan
Bahan
Mengukur pH medium
dan Larutan
Mengamati sel bakteri
Lab. Mikrobiologi
Mengukur nilai OD
Lab. Lingkungan
Memisahkan
supernatan
Memanaskan medium
Mengambil suspensi
Menginkubasi bakteri
Menginkubasi bakteri
anaerob
7
8
9
Hot plate & stirrer
Mikropipet & tip
Inkubator
10
Anaerobic jar
Oxoid anerojar
11
Buret & statif
PTFE stopcock
Titrasi Asam Laktat
12
Cawan petri
Iwaki Pyrex
13
Tabung Reaksi
Iwaki Pyrex
14
15
16
Labu Erlenmeyer
Gelas Ukur
Pipet Ukur
Iwaki Pyrex
Iwaki Pyrex
Iwaki Pyrex
17
Refrigerator
Show case
18
Beaker glass
Iwaki Pyrex
19
UV Cabinet
Camag UV Cabinet II
Kultivasi bakteri
Uji Biokimiawi &
peremjaan bakteri
Wadah medium
Mengukur larutan
Mengambil larutan
Menyimpan sampel &
media
Wadah medium &
larutan
Melihat perpendaran
warna koloni bakteri
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
HCl
Kasein
Buffer fosfat
NaOH
Fenolftalin
Folin ciocalteu
Tirosin
TCA
MRSB
King’s B
0,1 M
2%
0,5 M
1N
0,1%
10 mM
10%
oxoid
oxoid
Kegunaan
Disinfeksi meja kerja
Larutan buffer
Pelarut dalam pembuatan larutan
standar
Substrat enzim protease
Larutan buffer
Uji titrasi asam laktat
Indikador warna uji asam laktat
Pereaksi uji aktivitas protease
Larutan standar
Penghenti reakasi aktivitas protease
Media tumbuh BAL
Media tumbuh Pseudomonas sp.
xxi
Lab. Mikrobiologi
Lab. Mikrobiologi
Sentrifuge
Spesifikasi
70%
0,05 M
Lab. Mikrobiologi
Menginkubasi bakteri
6
No
Nama Bahan
1 Alkohol
2 Buffer Tris- HCl
Tempat
Lab. Mikrobiologi
Lab. Mikrobiologi
Lab. Mikrobiologi
Lab. Mikrobiologi
Lab. Mikrobiologi
Lab. Fiosiologi
Tumbuhan
Lab. Mikrobiologi
Lab. Mikrobiologi
Lab. Mikrobiologi
Lab. Mikrobiologi
Lab. Mikrobiologi
Lab. Mikrobiologi
Lab. Mikrobiologi
Lab. Mikrobiologi
13
14
15
Susu Sapi
Skim
Akuades
Bahan dasar yoghurt
Bahan untuk yoghurt
Pelarut
xxii
Lampiran
3.
Komposisi dan Pembuatan Media Pertumbuhan
L. bulgaricus dan B. bifidum (Oxoid, 2009)
S.
thermophilus,
a. Pembuatan Media deMann Rogosa Sharpe Agar (MRSA)
Komposisi :
Peptone
10 g
Lab-Lemco’powder
8g
Yeast extract
4g
Glucose
20 g
Sorbiton Mono-oleate
1 ml
Dipotasium hydrogen phosphate
2g
Sodium acetate 3H2O
5g
Triammonium citrate
2g
Magnesium Sulphate 7H2O
0,2 g
ManganeseSulphate 4H2O
0,05 g
Agar
10 g
Akuades add
1000 ml
pH 6,2 ± 0,2
 Cara pembuatan:
Sebanyak 62 Gram MRS Agar dilarutkan ke dalam 1000 ml akuades dalam
beaker glass, dihomogenkan dengan hot plate dan magnetic stirrer sampai homogen.
pH media diukur sekitar 6,2 ± 0,2 dengan mencelupkan kertas pH universal ke dalam
media MRSA, apabila pH media terlalu asam maka ditambahkan NaOH 1 N dan apabila
terlalu basa maka ditambahkan HCl 1 N. Setelah itu media dituang ke dalam tabung
reaksi sebanyak 5 ml, ditutup dengan cotton plug dan disterilisasi dengan autoklaf
pada suhu 121oC, tekanan 2 atm selama 15 menit. Kemudian disimpan pada papan
cetakan miring sampai memadat.
b. Pembuatan Medium deMannRogosa Sharpe Broth (MRSB)
Komposisi :
Peptone
10 g
Lab-Lemco’powder
8g
Yeast extract
4g
Glucose
20 g
Sorbiton Mono-oleate
1 ml
Dipotasium hydrogen phosphate
2g
Sodium acetate 3H2O
5g
Triammonium citrate
2g
Magnesium Sulphate 7H2O
0,2 g
Manganese Sulphate 4H2O
0,05 g
Akuades add
1000 ml
 Cara pembuatan:
Sebanyak 52 Gram MRS broth dilarutkan ke dalam 1000 ml akuades dalam
labu Erlenmeyer, dihomogenkan dengan hot plate dan magnetic stirrer sampai
homogen. pH media diukur sekitar 6,2 ± 0,2 dengan mencelupkan kertas pH
universal ke dalam media MRSA, apabila pH media terlalu asam maka ditambahkan
NaOH 1 N dan apabila terlalu basa maka ditambahkan HCl 1 N. Media MRSB
dituang ke dalam tabung reaksi sebanyak 8 ml, kemudian ditutup dengan cotton
plug, dilanjutkan dengan sterilisasi menggunakan autoklaf pada suhu
121 ºC
tekanan 2 atmosfer selama 15 menit
xxiii
c. Pembuatan Medium King’ B
Komposisi
Protease Pepton
20 gr
K2HPO4
1,5 gr
MgSO4
1,5 gr
Gliserol
10 gr
Akuades
1000 ml
Agar
20 gr
 Cara pembuatan:
Sebanyak 53 Gram King’B dilarutkan ke dalam 1000 ml akuades dalam labu
Erlenmeyer, dihomogenkan dengan hot plate dan magnetic stirrer sampai
homogen. pH media diukur sekitar 7,2 ± 0,2 dengan mencelupkan kertas pH
universal ke dalam media MRSA, apabila pH media terlalu asam maka ditambahkan
NaOH 1 N dan apabila terlalu basa maka ditambahkan HCl 1 N. Media MRSB
dituang ke dalam tabung reaksi sebanyak 8 ml, kemudian ditutup dengan cotton
plug, dilanjutkan dengan sterilisasi menggunakan autoklaf pada suhu
121 ºC
tekanan 2 atmosfer selama 15 menit
xxiv
Lampiran 4. Pembuatan Starter S. thermophillus, L. bulgaricus dan B. bifidum (Koroleva,
1991)
S. thermophillus (St)
Susu bubuk skim 8.5 gr + sukrosa 10 gr
ekstrak ragi 0.1 gr + akuades 100 ml
L. bulgaricus (Lb) atau
B.bifidum (Bb)
Susu bubuk skim 8.5 gr + akuades 100 ml +
Sterilisasi (tindalisasi)
Medium tumbuh (A)
1.0% St/Lb/Bb dalam pepton 0.1%
(OD ± 0.5)
inkubasi 12 jam. 37 oC
Media tumbuh (B)
inkubasi 24 jam. 37 0C
Kultur Induk
Kultur Induk
3 ml kultur induk + media
tumbuh (A) 97 mL
3 ml kultur induk + media
tumbuh (B) 97 mL
inkubasi 6 jam. 37oC
inkubasi 12 jam. 37oC
Feed Starter
Feed Starter
3 ml feed starter + media
tumbuh (A) 97 mL
3 ml feed starter + media
tumbuh (B) 97 mL
inkubasi 6 jam. 37 oC
inkubasi 12 jam. 37 oC
Bulk Starter
Bulk Starter
xxv
Lampiran 5. Tahapan Kerja Uji Aktivitas Enzim Protease
Bahan
Sampel
Standar
Kontrol
1. Ekstrak enzim kasar
0,5 ml
-
0,5 ml
2. Buffer tris-HCl (0,005
M pH 7)
0,5 ml
-
0.5 ml
Divorteks dan diinkubasi 37oC, 5 menit
1. TCA 0,4 M
2. 2% kasein dalam 0,05
M buffer fosfat pH 7
1. TCA 0,4 M
1.
2.
3.
1.
0,5 ml
-
Diinkubasi 37oC, 10 menit
1 ml
-
1 ml
0,5 ml
-
Divorteks dan disentrifuge selam 10 menit, 4000 rpm
Supernatan
0,5 ml
0,5 ml
Tirosin dengan
0,5 ml
berbagai konsentrasi
Na2CO3 0,5 M
2,5 ml
2,5 ml
2,5 ml
o
Dihomogenkan dan diinkubasi 37 C, 5 menit
Folin ciocalteu
0,5 ml
0,5 ml
0,5 ml
o
Dihomogenkan dan diinkubasi 37 C, 30 menit
Diukur absorbansinya menggunakan spektrofotometri λ= 660 nm
Dihitung aktivitasnya
xxvi
Lampiran 6.
Kadar Asam Laktat Rata-Rata Yoghurt Berbagai Konsentrasi Starter yang
Disimpan Selama 30 hari
8,00
7,00
Kadar asam laktat (%)
6,00
5,00
A0
4,00
A1
A2
3,00
A3
2,00
1,00
0,00
0
5
10
15
20
25
30
Lama Penyimpanan (hari)
Lampiran 7. Rata-Rata Total Bakteri Asam Laktat Yoghurt Berbagai Konsentrasi Starter yang
Disimpan Selama 30 hari
10,00
9,00
8,00
7,00
log sel
6,00
A0
5,00
A1
4,00
A2
3,00
A3
2,00
1,00
0,00
0
5
10
15
20
lama penyimpanan (Hari)
xxvii
25
30
Lampiran 8. Rata-Rata Total Bakteri Psikrotrofik Yoghurt Berbagai Konsentrasi Starter yang
Disimpan Selama 30 Hari
9,00
8,00
7,00
Log sel
6,00
5,00
A0
4,00
A1
A2
3,00
A3
2,00
1,00
0,00
0
5
10
15
20
25
lama penyimpanan (Hari)
Keterangan:
A0 : 3 % Starter S. thermophillus : 3 % L. Bulgaricus : 0 % B. bifidum (1:1:0)
A1 :3 % Starter S. thermophillus : 3 % L. Bulgaricus : 1,5 % B. bifidum (1:1:0,5)
A2: 3 % StarterS. thermophillus : 3 % L. Bulgaricus : 3 % B. bifidum (1:1:1)
A3: 3 % Starter S. thermophillus : 3 % L. Bulgaricus : 4,5 % B. bifidum (1:1:1,5)
xxviii
30
Lampiran 9. Gambar Hasil Pembuatan
L. bulgaricus dan B. bifidum
Inokulum dan starter
S. thermophillus,
Starter
Inokulum
Yoghurt B. bifidum hari ke-30
Yoghurt B. bifidum hari ke-0
xxix
Lampiran 10. Gambar Hasil Pengukuran Aktivitas Protease, Kadar Asam Laktat Yoghurt dan
Perhitungan Total BAL dan Bakteri Psikrotrofik
Hasil Pengukuran Kadar Asam
Laktat Yoghurt
Hasil Uji Aktivitas Protease Bakteri
Psikrotrofik pada Yoghurt
Bakteri Psikrotrofik pada Medium
King’s B
Bakteri Asam Laktat Yoghurt pada
Medium MRSA
xxx
Lampiran 11. Kurva Standar Uji Aktivitas Protease
Data Hasil Absorbansi Pengukuran Aktivitas Protease
Ulangan
1
Konsentasi (Mm)
0
abs
0.1
0.2
0.1455 0.244 0.3635
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.504
0.5885
0.76 0.8665 0.9635 1
KURVA STANDAR TIROSIN
1,4
y = 1,2354x + 0,001
R² = 0,9976
Absorbansi
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
Konsentrasi (mM)
Data Hasil Rata-Rata Uji Aktivitas Protease Bakteri Psikrotrofik pada Yoghurt selama
Hari
0
5
10
15
20
25
30
A0
0.00
7.02
7.18
4.64
3.13
2.98
0.00
Aktivitas Protease (U/ml)
A1
A2
0.00
0.19
6.23
4.48
5.80
3.91
4.99
1.13
2.70
0.00
0.00
0.00
0.00
0.00
A0 : 3% Starter S. thermophillus : 3% L. bulgaricus : 0% B. bifidum (1:1:0)
A1 : 3% Starter S. thermophillus : 3% L. bulgaricus : 1,5% B. bifidum (1:1:0,5)
A2 : 3% Starter S. thermophillus : 3% L. bulgaricus : 3% B. bifidum (1:1:1)
A3 : 3% Starter S. thermophillus : 3% L. bulgaricus : 4,5% B. bifidum (1:1:1,5)
xxxi
A3
0.24
4.07
2.10
0.08
0.00
0.00
0.00
0.9
1
1
1