Penambahan Growth Differentiation Factor-9 (GDF

VETERINARIA Medika
Vol. 3, No. 1, Pebruari 2010
Penambahan Growth Differentiation Factor-9 (GDF 9)
pada Medium Kultur In Vitro Terhadap Profil Kromosom Oosit Sapi
Addition of Growth Differentiation Factor-9 (GDF-9)
At Culture Medium In Vitro on Chromosome Profile of Bovine's Oocyte
1Widjiati, 2Nunung Aji
Wibowo, 1Indah Norma Triana
1 Fakultas Kedokteran Hewan Unair
2 PPDH Fakultas Kedokteran Hewan Unair
Kampus C Unair, Jl. Mulyorejo, Surabaya-60115.
Telp. 031.5992785, Fax. 031.5993015
Email : [email protected]
Abstract
Growth Differentiation Factor - 9 (GDF-9) was a member of the TGF-â superfamily known to regulated
ovarian functions in mammals. The aim this research was to find out the influenced suplementation GDF-9 toward
maturation degree of bovine's oocyte in vitro. The objective of the current study was to test the hypothesis influence
suplementation GDF-9 protein at the oocyte's maturation medium in vitro toward degree's maturation bovine's
oocytes. Oocytes were collected with aspiration technique for the folicles wich have 3 – 5 mm diameters. Furthermore
oocytes were matured within TCM 199 medium in wich additional amount 3% BSA, 50 µg / ml gentamycin sulfat,
1µg/ml FSH, 1µg/ml LH, 5 ng GDF-9, then oocytes cultured during 22 hours at 38,5º C temperature in the incubator
with 5% CO2. After 22 hours incubated later doing investigation oocyte maturation with 1 % aceto orcein dye for
observing figure M II. The result showed that Suplementation GDF-9 at a maturation medium gave influenced toward
maturation oocyte which is indicated incrase of number M II and showed significant different.
Keywords : Metafase II (M II), protein GDF-9, bovine's oocyte
Pendahuluan
Metode Embrio Transfer (ET) merupakan
teknik pemindahan embrio dari satu induk ke beberapa
induk resipien. Tahapan ET meliputi pengambilan sel
telur, maturasi, fertilisasi, dan transfer ke induk
resipien. Pada tahap penanaman embrio ke resipien
perlu dilakukan keseragaman siklus birahi yaitu
dengan sinkronisasi birahi. Hasil dari ET tersebut yaitu
memungkinkan diperoleh sejumlah pedet dengan umur
yang sama bahkan dapat diupayakan dengan
keseragaman genetik. Akan tetapi ET belum bisa
digunakan secara masal karena memerlukan biaya
yang tinggi dan keahlian khusus serta masih dalam
proses penelitian lebih lanjut (Mc Donald's, 2001).
Teknik Embrio Transfer (ET) memiliki
tingkat keberhasilan yang masih rendah, terlihat dari
jumlah kebuntingan yang terjadi dari embrio yang
dihasilkan secara in vitro kemudian ditransfer ke induk
resipien menunjukkan jumlah yang rendah. Rendahnya
angka kebuntingan dari teknik Embrio Transfer (ET)
antara lain disebabkan kualitas embrio yang dihasilkan
secara in vitro masih rendah yaitu dapat dilihat dari
nilai blastula IVF. Pelaksanaan Embrio Transfer (ET)
memerlukan embrio in vitro dengan kualitas bagus
yaitu dengan tingkat kematangan maksimal. Upaya
untuk meningkatkan kualitas embrio yaitu dengan
memperhatikan faktor spermatozoa dan faktor oosit.
Salah satu proses yang sangat berpengaruh pada
kualitas oosit adalah maturasi oosit. Proses maturasi
yang tidak sempurna akan mempengaruhi fertilitas
oosit sehingga berpengaruh pada produksi embrio in
vitro (Hunter, 2005).
Oosit dimaturasi secara IVM (In Vitro
Maturation) akan berkembang pada metafase II,
sehingga terjadi pematangan inti dan sitoplasma yang
ditandai dengan munculnya pronukleus . Media buatan
dalam maturasi in vitro harus disesuaikan dengan
kebutuhan oosit secara alami terutama harus kaya akan
zat-zat nutrisi. Dalam media buatan tersebut juga
menjadi tempat yang baik untuk pertumbuhan kuman
dan virus. Penambahan antobiotik ke dalam media
dapat mencegah berkembangnya kuman dan virus
sehingga proses maturasi oosit dapat berjalan lebih
sempurna ( Squires, 2003).
Gonadotropin Hormone yaitu FSH dan LH
memiliki pengaruh yang sangat besar untuk
merangsang maturasi oosit. FSH mempunyai reseptor
pada sel granulosa di dalam folikel yang berfungsi
untuk merangsang pertumbuhan folikel. LH disekresi
oleh kelenjar adenohipofisis dan memiliki reseptor
pada sel teka interna yang dapat mempengaruhi
steroidogenesis, luteolisis, ovulasi, dan pengaturan
siklus birahi. Kedua hormon tersebut memiliki peranan
yang sangat penting dalam mengatur aktivitas ovarium
. Dalam penelitian yang dilakukan oleh Squires (2003)
menyebutkan bahwa penambahan sintetik hormon
FSH ke dalam media buatan dapat memberikan
pengaruh pada proses maturasi oosit. Setelah proses
maturasi maka oosit segera difertilisasi secara in vitro
53
Widjiati dkk. Suplementasi Growth Differentiation ...
kemudian berkembang menjadi blastosis sebelum
proses pembekuan dan transfer kepada induk resipien.
Secara alami oosit menghasilkan suatu
molekul protein yaitu GDF-9 (Growth Differentiation
Factor-9) yang digunakan untuk pendewasaan dan
pematangan oosit. GDF-9 merupakan molekul
polipeptida famili dari TGF-â Growth Factor. Pada
proses perkembangan oosit yang normal maka GDF-9
sangat diperlukan sampai terjadi ovulasi. Massangger
atau mRNA GDF-9 tetap disekresikan oleh oosit
setelah ovulasi tetapi akan berhenti pada 1,5 hari
setelah fertilisasi (Mc Grath et al, 1995 ; Leitinen et al,
1999). Oleh karena itu maka perlu dilakukan penelitian
u n t u k m e n g i d e n t i f i k a s i p e n g a r u h G ro w t h
Differentiation Factor-9 (GDF-9) pada maturasi oosit
secara in vitro.
GDF-9 dapat menginduksi enzim Hyaluron
Sintetase (HAS2), Cyclooxygenase (COX2), dan
Steroidogenic Acute Regulator Protein (StAR) yang
memicu perkembangan sel cumulus tetapi menekan
pembentukan Urokinase Plasminogen Aktivator (uPA)
dan sintesis LH receptor (LRH) mRNA. Kejadian
tersebut membuat peningkatan GDF-9 bersifat
antagonis dengan LH secara alami di dalam sel
kumulus (Spicer et al, 2008).
(Elvin et al, 1999) menyatakan bahwa dengan
penambahan GDF-9 ke dalam media maturasi in vitro
dapat memperbesar ukuran sel kumulus. GDF-9 dapat
berikatan dengan receptor sel kumulus untuk
meningkatkan sintesis progesteron meskipun tanpa
pemberian FSH. Sehingga GDF-9 dapat bekerja
sinergis seperti FSH yang sangat penting untuk
perkembangan oosit dan reproduksi betina secara
nomal.
Gonadotropin Hormone memiliki peranan
yang sangat penting untuk mengatur proses reproduksi.
FSH dan LH adalah hormon yang mendorong
pertumbuhan folikel dan pematangan oosit.
Penambahan FSH ke dalam media pematangan secara
in vitro menghasilkan oosit-oosit mature yang lebih
baik daripada media TCM 199 tanpa perlakuan khusus
(Squires, 2003).
GDF-9 mempercepat proliferasi sel
granulosa yang digambarkan dengan peningkatan
gabungan thymidin. Sekresi GDF-9 dari oosit
mendorong sintesis androgen dan progesteron di dalam
sel teka. GDF-9 digunakan untuk mengatur fungsi sel
kumulus oosit kompleks sejak masa preovulasi sampai
terjadi persiapan fertilisasi (Sophie et al, 2004).
Materi dan Metode Penelitian
Peralatan yang digunakan untuk penelitian ini
antara lain adalah : gunting (Tajimaco S.S), pinset
(Tajimaco S. S), disposable syringe 5 cc (One Med),
jarum ukuran G18, cawan petri disposable (Merk
Falcon), Erlenmeyer, pipet Pasteur, pipet Eppendorff,
tabung Eppendorff, Alat centrifuge (Medifuge),
Freezer, Incubator CO2, gelas ukur, mikroskop
Inverted (Meiji).
54
Media kimia yang diperlukan antara lain
:Tissue Culture Media (TCM-199) merk MEM Eagle's,
NaCl fisiologis dan Diionized Water (DW),
Gentamycin Sulfat, Bovine Serum Albumin (BSA),
Phosphat Buffer Salin (PBS), aceto orcein, mineral oil,
NaHCO3, FSH merk Fullagon, LH merk Chorullon.
Sampel yang digunakan pada penelitian ini
adalah ovarium sapi yang diperoleh dari limbah Rumah
Potong Hewan kemudian diambil oositnya selanjutnya
dimaturasi dalam media maturasi yang dibagi menjadi
dua kelompok yaitu :
P0 : Media maturasi yang diberi tambahan FSH 1
µg/ml, BSA 3%, LH 1 µg/ml,
P1 : Media maturasi yang diberi tambahan FSH 1
µg/ml, BSA 3%, LH 1 µg/ml, dan GDF-9 5 ng/ml
Ovarium dibawa ke Laboratorium Fakultas
Kedokteran Hewan Universitas Airlangga untuk
mendapatkan oositnya. Ovarium dicuci dengan NaCl
fisiologis ditambah gentamicyn untuk menghindari
kontaminasi kuman. Melakukan koleksi oosit pada
ovarium dengan diameter permukaan 3-5 mm. Oosit
hasil koleksi kemudian dicuci di dalam medium
maturasi TCM 199, FSH 1 µg/ml, LH 1 µg/ml
sebanyak dua kali sampai bersih sebagai kontrol
sedangkan sebagai perlakuan oosit dicuci
menggunakan medium maturasi TCM 199, FSH 1
µg/ml, LH 1 µg/ml, GDF-9 5 ng/ml. Setelah bersih
oosit kemudian dimaturasi di dalam inkubator CO2,
dengan suhu 38,5º Celcius.
Untuk proses pematangan oosit digunakan
medium maturasi yang dibagi menjadi dua kelompok
yaitu :
P0 : Media maturasi yang diberi tambahan FSH 1
µg/ml, BSA 3%, LH 1 µg/ml,
P1 : Media maturasi yang diberi tambahan FSH 1
µg/ml, BSA 3%, LH 1 µg/ml, dan GDF-9
sebanyak 5 ng/ml
Oosit dikultur dalam 100 ul medium tetes
dan ditutup dengan mineral oil. Pematangan oosit
dilakukan pada suhu 38oC di dalam inkubator 5% CO2
selama 22 jam.
Oosit hasil maturasi diperiksa tingkat
kematangannya dengan metode pewarnaan aceto
orcein (Wu, et al 2006).
Hasil dan Pembahasan
Penelitian ini dilakukan untuk mengetahui
apakah teknik maturasi yang dijalankan mampu
meningkatkan kemampuan maturasi oosit yang
diisolasi dari folikel kecil secara in vitro. Pada
penelitian yang telah dilakukan bertujuan untuk
mengamati tingkat kematangan oosit berdasarkan
perubahan inti yang terdapat di dalam oosit. Setelah
mengalami maturasi selama 22 jam maka oosit
diwarnai dengan pewarnaan aceto orcein 1% untuk
mengetahui pola perkembangan pembelahan inti. Hasil
pengamatan tentang pengaruh suplementasi GDF-9
pada media maturasi oosit sapi dapat dilihat sebagai
VETERINARIA Medika
Vol. 3, No. 1, Pebruari 2010
Tabel 1 Rata-Rata Hasil Pengamatan Metafase II
Perlakuan
Rata-rata ± SD
P0
P1
16,11 ± 0,96b
38,89 ± 13,54a
Keterangan : Superskrip yang berbeda pada kolom
yang sama menunjukkan perbedaan
yang nyata (p<0,05). P0: Kontrol, P1:
Perlakuan dengan suplementasi
GDF-9 pada medium.
berikut :
Data yang diperoleh dilakukan analisis
statistik dengan menggunakan uji T (T-test). Perbedaan
yang nyata setelah dilakukan Uji T (T-test) ditunjukkan
pada perlakuan (P1) dengan media yang
disuplementasi GDF-9 dibandingkan dengan kontrol
(P0) yaitu pada pembentukan Metafase II (M II) dengan
asumsi (p<0,05).
Bahan – bahan yang digunakan untuk
maturasi oosit merupakan molekul – molekul yang
secara alami terdapat di dalam tubuh (in vivo). Faktor
yang paling penting untuk proses maturasi terutama
adalah FSH, LH dan beberapa Growth Factor.
Inkubator CO2 digunakan untuk menjaga suhu,
kelembaban, osmolaritas, dan pH seperti di dalam
tubuh supaya kegiatan sel tetap berjalan (Squaires,
2003).
Teknik pewarnaan oosit yang digunakan pada
penelitian ini adalah aceto orcein. Pewarnaan tersebut
bertujuan untuk mengetahui tahapan proses
pembelahan yang terjadi di dalam oosit. Setelah
mengalami maturasi selama 22 jam oosit dipindahkan
ke dalam glass object kemudian direndam di dalam
larutan fiksatif selama 24 jam. Larutan fiksatif tersebut
dibuat dari 6 bagian alkohol absolut dan 1 bagian dari
larutan acetic acid. Tujuan dari proses fiksasi adalah
untuk dehidrasi supaya zat warna mudah diserap oleh
sel. Oosit diwarnai dengan zat pewarna orcein dengan
cara meneteskan pewarna tersebut ke dalam preparat
glass object. Zat pewarna akan memberikan warna
yang kontras terhadap nukleolus dan kromosom
sehingga dapat diamati tahapan dari proses pembelahan
oosit (Barry and Perkins, 2001).
Sebagai sel somatik, siklus sel oosit diatur
oleh aktivitas protein yang dikenal dengan Cyclin
Dependent Kinase (cdk) dan GDF-9. Banyak penelitian
membuktikan bahwa pentingnya peranan GDF-9
sebagai stimulator saat perkembangan folikel primer
serta fungsinya terhadap perkembangan sel granulosa
pada folikel antral dan preantral. Dengan penambahan
GDF-9 terlihat adanya laju pertumbuhan folikel primer
dan folikel preantral pada saat in vivo. Sel kumulus
mengalami perkembangan karena peningkatan
produksi androgen pada sel teka serta didukung dengan
sel granulosa yang menekan produksi inhibin. GDF-9
juga mempengarui berbagai fungsi sel ovarium
termasuk sintesis DNA sel granulosa dan proses
steroidogenesis (Jayawardana et al, 2004).
GDF-9 memiliki peranan dalam
perkembangan folikel primer serta deferensiasinya.
GDF-9 mampu menstimulasi
produksi TIC
androstenedione karena kemampuannya berhubungan
dengan deferensiasi sel teka pada preovulatory folikel.
Perkembangan folikel dihubungkan dengan adanya
peningkatan androgen yang memproduksi enzim
cytocrom P450, kemudian mengalami penurunan
setelah adanya stimulasi LH dan hCG. Maka exspresi
GDF-9 tertinggi pada oosit menunjukkan bahwa GDF9 lebih banyak dan aktif selama stadium awal
perkembangan folikel (Jinwen, 2005).
Penelitian dari (Shimizu et al, 2004)
menyebutkan bahwa injeksi GDF-9 pada mencit dapat
meningkatkan jumlah folikel primer dan folikel
sekunder serta menurunkan jumlah folikel primordial.
Aplikasi injeksi GDF-9 pada in vivo dapat
meningkatkan jumlah folikel primer dan preantral.
Penemuan tersebut menunjukkan bahwa folikel dapat
tumbuh pada stadium primer dengan pemberian GDF9. Penemuan tersebut dapat membuktikan bahwa GDF9 dapat mempercepat masa transisi dari folikel
primordial menjadi primer. Didukung dengan
penelitian dari (Vitt et al, 2002) yang menyatakan
bahwa folikel primordial mulai melakukan
pertumbuhan dengan injeksi GDF-9. Injeksi GDF-9
merupakan metode yang efektif dalam merangsang
folikel primordial untuk tumbuh. Penemuan tersebut
dapat dijadikan aplikasi untuk mengatasi infertilitas
pada hewan betina.
GDF-9 telah meningkatkan pertumbuhan
folikel primer secara in vivo dan kelangsungan hidup
oosit pada media kultur in vitro. Pemberian GDF-9
pada jaringan ovarium mencit dapat mengubah
susunan ovarium dan merangsang pertumbuhan folikel
primer. Hal tersebut menunjukkan bahwa GDF-9
merupakan faktor yang sangat penting dalam
perkembangan oosit. Folikel primordial dapat berubah
selama in vivo, tetapi peningkatan signifikan dalam
presentase dari folikel primordial tidak dapat diamati
karena GDF-9 juga mempercepat peralihan folikel
primordial menjadi primer, primer menjadi sekunder
(Kaivo-oja, 2007).
Penjelasan tersebut di atas menerangkan
bahwa protein GDF-9 dapat menginduksi pematangan
oosit ditunjukkan dengan adanya peningkatan
pembentukan M II.
Kesimpulan
Berdasarkan pengamatan dari hasil penelitian
suplementasi protein GDF-9 (Growth Differentiation
Factor – 9) pada media kultur in vitro oosit sapi dapat
memberikan pengaruh terhadap tingkat kematangan
oosit yang ditunjukkan dengan peningkatan jumlah M
II.
Daftar Pustaka
Barry E.G. and Perkins D.D. 2001. How to prepare
aceto-orcein squashes, especially for pachytene
chromosomes. Academic Press. San Diego.
55
Widjiati dkk. Suplementasi Growth Differentiation ...
Elvin J.A., Clark A.T., Wang P., Wolfman N.M., and
Matzuk M.M. 1999. Paracrine actions of
Growth Differentiation Factor-9 in the
mammalian ovary. Mol Endocrinol 13: 10351048.
Hunter,R.H.F. 2005. Fisiologi dan Teknologi
Reproduksi Hewan Betina Domestik. Penerbit
ITB dan Penerbit Universitas Udayana.
Hyttel P.I., Callsen F.H., And Greve I. 2000. Oocytes
growth, capacitation and final maturation in
cattle. J. Theriogenologi. Biol Reprod 47: 2332.
Jayawardhana B.C., Shimizu T., Hiromi N., and Etsushi
K. 2004. Hormon regulator of expression
Growth Differentiation Factor-9 receptor tipe I
and tipe II genes in vitro the bovine ovarium
folicle. Reproduction 131: 543.
Jinwen D. 2005. Growth Differentiation Factor-9 is
required during early ovarian folliculogenesis.
Biol Reprod 75: 531-535.
Kaivo-oja N. 2007. Growth Differentiation Factor-9
Signalling in the Ovary. Thesis. Hartman
Institute University of Helsinki. Finland.
Laitinen M., Vuojolainen K., Jaatinen R., Ketola I.,
Aaltonen J., Lehtonen E., Heikinheimo M., and
Ritvos O. 1999. A Novel Growth
Differentiation Factor-9 (GDF-9) related factor
is Co-Expressed with GDF-9 in mouse oocytes
during folliculogenesis. Sciencedirect 73: 144149.
Mc Donald's. 2001. Veterinary Endocrinology and
Reproduction. 7th.ed. M.H. Pinda Iowa States
Press. United States of America. 285-295.
Mc Grath S.A., Esquela A.F., and Lee S.J. 1995.
Oocytesspecific expression of Growth
D i ff e r e n t i a t i o n F a c t o r- 9 . M o l e c u l a r
Endocrinology 9: 131-136.
56
Shimizu T., Miyahayashi S., Yokoo M., Hoshino Y.,
Sasada H., and Sato E. 2004. Molecular cloning
of porcine Growth Differentiation Factor-9
(GDF-9) cDNA and its role in early
folliculogenesis: direct ovarian injecton of
GDF-9 gene fragments promotes early
follicolugenesis. Reproduction. 128: 537-543.
Sophie P., Uzbekova S., Perreau C., Papillier P.,
Mermillod P., and Dalbie”s R. 2004. Spatiotemporal expression of the germ cell marker
genes MATER, ZAR 1, GDF-9, BMP 15, and
VASA in adult bovine tissues, oocytes, and
preimplantation embryos 1. Science Direct 71:
1359-1366.
Spicer, Allen D.T., Muzerbourg S., Payne A.H.,and
Hsuech A.J. 2008. Stimulated proliferation and
inhibit steroidogenis by bovine theca cells
influence of folicle size on respones to GDF-9.
Biol Reprod 78: 329-335.
Sulaiman. 2005. Statistik Non-Parametrik. Edisi II.
Penerbit Andi Offset Yogyakarta.
Squaries E.J. 2003. Appllied Animal Endocrinology.
Cromwell Press. Trowbridge.UK.
Tamer S.H. and David A. 2005. Oocytes prevent
cumulus cell apoptosis maintaining a
morphogenic paracrine gradient of bone
morphogenetic proteins. Journal of Science
10: 5257-5267.
Vitt U.A., Mazerbourg S., Klein C.,and Hsueh A.J.W.
2002. Bone morphogenetic protein receptor for
Growth Differentiatio Factor-9. Biol Reprod.
67: 473-480.
Widjiati. 2006. Induksi Maturasi Oosit Secara In Vitro
Oleh Transforming Growth Factor Basal Oosit
Cumulus Komplek. Disertasi. Universitas
Brawijaya . Malang.
Winda. 2006. Siklus Hidup Ovarium. Review Article.