isolasi dan identifikasi bakteri patogen penyebab kematian ternak sapi

Tenru Teknis Fungsional non Penelid 2000
ISOLASI DAN IDENTIFIKASI BAKTERI PATOGEN
PENYEBAB KEMATIAN TERNAK SAPI
Supariono
Balai Peneftian Veteriner, .TL RE. Martadinata, 30, Bogor 16114
RINGKASAN
Pemeliharaan ternak yang tidak didukung oleh pengetahuan kesehatan
hewan sering mengakibatkan kerugian ekonomi seperti kematian akibat penyakit
menular, salah satu penyakit menular yang banyak ditemukan pada ternak sapi adalah
penyakit ngorok yang disebabkan infeksi bakteri patogen yang dikenal dengan
Pasteurella multocida. Untuk membuktikan penyebab kematian sapi yang didiagnosis
penyakit ngorok, maka pengupan laboratonum perlu dilakukan terhadap spesimen atau
organ yang diambil dan hewan mati. Pengambilan sampel biasanya dilakukan segera
setelah hewan dibedah/autopsi dalam keadaan segar di laboratonum . Organ yang akan
dipenksa digerus hingga lembut untuk mendapatkan suspensi organ dan selanjutnya
dibiakkan pada media agar darah dan MacConkey agar. Isolasi dan identifikasi agen
penyebab kematian dimulai dari pengamatan morfologi koloni dan mikroskopis.
Pengujian untuk idennfikasi dimulai dan genus hingga pengujian gula-gula untuk
pengamatan aktivitas biokimia sebagai data pendukung untuk mengetahui spesies dari
bakteri yang diisolasi. Semua perubahan uji kimiawi dicatat dan dicocokkan dengan
daftar atau tabel standar, Pengujian dilakukan secara teliti dan bila perlu dilakukan
pengulangan hingga menghasilkan data yang akurat. Uji biologis dengan
menggunakan hewan percobaan dilakukan untuk mengetahui patogenitas bakteri yang
diisolasi dan identifikasi benar-benar membunuh hewan percobaan.
Kata kunci : Isolasi, Bakter palogen, kemtian sapi.
PENDAHULUAN
Isolasi dan identifikasi merupakan salah satu teknik untuk mengetahui
penyebab kematian pada ternak akibat infeksi bakten patogen. Kedua kegiatan tersebut
dilakukan di laboratonum diagnosik untuk mengetahui penyebaran, pencegahan dan
bahkan pengobatan penyakit . Ketepatan diagnosis dipengaruhi oleh berbagai faktor
antara lain ketepatan pemilihan spesimen diagnosis dan pengiriman ke laboratonum.
Pengetahuan dan keterampilan dalam penguasaan teknik diagnosis twut mendukung
keberhasilan diagnosis ini serta pembuatan media pertumbuhan dan peralatan yang
memenuhi persyaratan.
Pada saat ini banyak metoda untuk identifikasi sejalan dengan berkembangnya
ilmu pengetahuan dan teknologi, namun metoda diagnosis tersebut membutuhkan
peralatan dan biaya yang cukup tinggi . Dilain pihak teknik konvensional yang
65
Temu Telrnis Fungsional non Pemba 2000
dilakukan secra bertahap di dalam pengujian (BERGEYS, 1984) masih memberikan
hasil yang dapat diandalkan. Cara lain dengan menggunakan Kit (Microbact Mb 24
Miscelaneus) cukup praktis dan sederhana dengan hasil yang cepat tetapi tidak semua
mikroba dapat terdeteksi. Cara lain yaitu gabungan antara manual dan reaksi dimlai
dalam bentuk point atau angka yang diolah dengan Komputer. Tekmk benkutnya
adalah penggunaan kartu masterldischotomous keys dimana kuman yang sudah
diketahui genus dan spesiesnya pada kartu dibuat tabel dan reaksi dibentuk lubanglubang dan dicocoKkan dengan hasil yang kits dapatkan. Dalam hal ini penulis hanya
membahas salah satu teknik identifikasi secara manual satu persatu dilakukan
pengujian hingga dapat dihasdkan mulai dari genus suatu kuman serta didukung reaksi
biokimiawi sampai diketahui spesies dan "man hasil isolasi .
BAHAN DAN METODA
Bahan
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Media agar dash (darah domba 5-6%)
Media MacConkey agar
Media cair BI-H, Nutrien, serum broth
Media uji karbohidrat
Media uji gala-gala (untuk Biokimia)
Buku/lembar daftar uji
Metoda
Spesimen atau organ yang dikoleksi dari lapangan atau yang dikirim ke
laboratorium seperti limpa, hati, jantung, diambil sebagian suspensinya dengan
menggunakan pipet Pasteur, atau digerus terlebih dahulu hingga lemb t kemudian
dibiakkan pada medium kaldu cair (Nutrien broth, BHI, serum broth) atau langsung
dibiakkan pada media agar darah dan MacConkey agar. Selanjutnya suspensi yang
diperoleh dinkubasi pada suhu 37° C atau suhu lain dengan sifat-sifat dari bakteri
yang memerlukan suhu lebih tinggi pada 42-45° C seperti bakten thermophilie.
Identifikasi dimulai dan pengamatan morfologi koloni setelah dunkubasi selama 24
atau 48 jam. Bila biakan belum memperlihatkan pertumbuhan maksimal, maka
dilakukan pengamatan nukroskopis untuk mempelajan bentuk (shape) kolom dengan
bantuan pengecatan zat warns menurut metode Gram (COWAN & STEEL, 1974).
Hasil dari pengecatan dapat dilihat dari pembentukan warns biru untuk
bakten gram positif dan merah untuk bakten gram negatif Selanjutnya pengujian
katalase dan oksidase, dalam hal ini sebagaian dan uji yang mengarah ke genus dan
biakan kuman yang akan dican dapat dicocokkan pada tabel yang sudah standar.
Setelah genus dapat diketahui kuman yang sudah dipilih dan dimurnikan lalu
disubkultur pada media cair nutrien (Difco) atau BM diinkubasi hingga cukup
Tenm Tekrrta Flngsiond non Pemhg 2000
kekeruhannya dan dilakukan pengujian untuk mengetahui spesies kuman yang
berkualitas.
Prosedur Pembiakan Spesimen
Banyak jenis spesimm yang dildrim oleh petugas lapangan untuk
pemeriksaan laboratorium serta banyak pula jems bakten yang akan diisolasi dan
terjadi kesalaban pada pemilihan jenis spesimen sermg
dudentifikasi, masih
tepat
sasaran Minimnya informasi yang disampaikan pada
mengakibatkan tidak
spesimen
pada
saat melakukan bedah hewan dapat mempenganilu
. lembar penganter
(label
1).
keberhasilan tersebut
Tabel. 1 Prosedur pemprosesan spesimen
jam.
prgaty
asnW uioe, swab
Feses, l
feat swab
Usus, lasmta
Organ, isi, ums, feat
swab
D fliskon
Aaobic
Media
Agar dwsh Moc, BliL
medium semi solid
Read»n
Aaobik
Suhu
37" C
Endwik baktai
Micro
Anseaob
(clostridia)
Sekaith, SS agar, Mcc
TSA, DSA selektif mod
BA, RCMM,
Thioglyeollate, BHI semi
solid
Aerob&
10% Co &uodk
Anaaobik
37,42° C
37" C
37° C
Carter (1973)
Urutan identifikasi menentukan Genus dari bakteri
1. Shape (bentuk)
Dengan slat bantu mikroskop pembesaran 1000 x dapat dilihat bentuk
mikroba yang diisolasi dan telah dimumikan. Pengamatan dilakukan berdasarkan
bentuk kuman seperti bulat (Coccus/Sphere) dan jenisnya seperti bergerombol
membentuk kumpulan atau menyambung satu sama lain membentuk mntai
(Streptococcus sp). bentuk batang (R7-Rod) sama seperti di alas memilik bentuk batang
yang bervariasi dalam ukurannya seperti kecil atau lembut (Corynebacterium sp),
bentuk besar (Bacillus sp) dengan bantuan zat warm pengecatan kuman dengan
metoda Gram bisa dilihat warm merah untuk bakteri bersifat gram negatif dan bakteri
yang berwama biru untuk gram positif
2.
Motilitas atau pergerakan
Ada dua cars untuk melihat pergerakan dari aktivitas bakten. Penusukan
pada agar semi solid medium, ose yang digunakan ose yang lurus, bidang tusukan dan
alas hingga dasar tabung, reaksi memperlihatkan perubahan warm keruh dari tusukan
menyebar ke segala arah. Reaksi negatif tidak terjadi perubahan tersebut. Cara
penetesan pads glass slide atau preparat tetes gantung kuman yang akan diamati telah
ditumbuhkan pada media cair 4 atau 24 jam. Pengamatan dengan cars meneteskan
67
Tom Tebds FLngsonal nonPenelth 2000
cairan pada cover glass yang diben bantalan cincin karet selebar glass slide lalu
dibalikkan hmgga posisi cairan tergantung, dengan mikroskop pembesaran 400 x
dilihat aktivitas pergerakan dengan dua katagon yaitu untuk pergerakan cepat sekali
untuk positif realm, sedangkan pergerakan hanya disekitar kelompoknya: berarti
negatif
Pertumbuhan aerobik
Kemampuan untuk bisa tumbuh pada kondisi aembik, dalam arti kkuman untuk
tumbuhnya masih memerlukan oksigen perttimbiihan bisa pada temperaatur ruangan
atau dunkubasi pads leman pengeram atau mkubator 37° C, untuk pembiakan tersebut
bisa pada media cair (broth) atau pada agar petri pertumbuhan bisa dilihat pada jam ke
empat hingga pertumbuhan menjadi berubah keruh bila pada media cair, sedangkan
pads agar pada awal pertumbuhan hanya dapat dilihat bintik-bintik lembut hingga
membesar pads pertumbuhan optimal sesuai kebutuhan nmasingmasing yang berbeda
(Topley dan Wilson, 1975) .
Pertumbuhan An erobik
Kemampuan untuk bisa tumbuh pada kondisi tanpa udara atau oksigen,
dalam hal ini kuman diinkubasikan dalam suatu bejana kapasitas 2,5 liter terbuat dari
logam atau plasuk udara dikeluarkan dengan macam cara, satu diantaranya yaitu yang
disebut Candle jar, pads bejana itu dimasukkan sepotong lilin yang menyala, selama
persediaan udara masih ada dalam bejana itu lilin menyala dan apabila dalam waktu
beberapa menit lampu itu akan segera pada menandakan bahwa udara dalam bejana itu
telah habis. Cara yang kedua dengan
nggunakan Gaspak (Gas generating kit)
berupa amplop atau kantong kedap air yang apabila dimasukkan air sebanyak 10 cc
akan memmbulkan reaksi berupa gas yang memenuhi ruang bejana tersebut sehingga
kondisi pada mejana tersebut dalam keadaan tanpa udara, dan selanjutnya
pada temperatur yang sesuai kebutuhan.
Pengujian Katalase
Dengan bantuan lamtan Hydrogen peroksida (H202) dilamtkan 3% dan
disimpan atau diteteskan pada gelas preparat sebanyak dua atau tiga tetes, biakan
kuman yang sudah tumbuh diambil menggunakan Pipet Pasteur yang dibengkokkan
atau dengan kawat ose Wit disentuhkan ujung pipet yang mengandung biakan tersebut,
dilihat perubahan yang ditimbulkan, dalam beberapa detik terlihat buih/gelembung
berarti kuman bereaksi positif, untuk negatif sebahknya .
Pengujinn Oksidase
Biakan kuman yang sudah ditumbuhkan pada media agar darah diambil
dengan kawat ose atau pipet Pasteur lalu ditempelkan pada kertas wring yang sudah
68
Tenor Tekms Fungsfonol non Penehd 2000
basah ditetesi larutan tetra methyl-p-phenylene diamine dichlonda reaksi dapat dilihat
dalam hitungan detik yaitu terdapat warns biru atau violet untuk reaksi positif
Pengujian karbohidrat untuk genus dan gula-gula untuk spesies bakteri
Untuk mendukung pengujian genus tahap pertama yaitu katalase, oxidase
dan selanjutnya dilanjutkan dengan pengujian seperti Simmon Citrate, Tsia-gelatin test
dan yang lamnya. Pada prinsipnya media yang digunakan yaitu agar miring dalam
slope (tabung) yang apabila dibiakkan kuman ke media penguji tersebut akan bereaksi
perubahan warns Brom tymol blue atau phenol red. Perubahan bervariasi dari hari ke
dua sampai hari ke tujuh.
Setelah pengupan karbohidrat selesai dilanjutkan dengan uji gula-gula
seperti arabinosa, lactosa, maetosa, manitol dll, media uji ini disimpan dalam botol isi
2,5 ml berwarna merah, apabila kuman yang akan diuji dengan cars me masukkan
beberapa tetes kedalamnya akan terjadi peubahan warns, bila dalam 24 jam atau 48
jam berubah warns menjadi Joining menandakan kuman yang diuji positif dan untuk
negatif tidak terjadi perubahan warns (masih merah) .
Tabe12. Pengujian (Pasteurella)
-Reaksi Gram -batang bipoler
-Motitity
-Catalase
+
-Arabinose
-Lactose
-Manitol
-Rafinosa
d
d
+
-
-Sorbitol
-Sucrose
-Trehalose
-Xylose
-Reaksi Nitrate
-Indole
-Gelatin
-Urease
-H2S
d
+
d
d
+
+
d
-
Keterangan (d) = dubius 60-70% positif
69
r~ r tw Fungafasd mm Psesuri 2000
HASIL DAN PEMBAHASAN
dan
Setelah dilakukan pembiakan sampel/organ pada media
selanjutnya dilakukan pembuktian, dimulai dengan pengamatan marphologi lain
pengujian terhadap genus, species dari kuman yang berhasil dnsolasi sepanjang faktor
pendukung lain diperhatikan. Peinbuatan media serta tepat tidaknya pemilihan organ
darn spesimen yang dikirim ke laboratorium .
Pengamatan mikroskopis sampan pengujian biokimiawi dilakukan dengan
teliti, sehmgga diperoleh data pengujian darn test yang dilakukan dan selanjutnya
dicocokkan dengan tabel yang sudah standar menunrt buku panduan yang sudah
dibakukan.
KESIINIPULAN
Pengujian dan bakten hasil isolasi dan hewan sapi yang terkena mfeksi
PasteuwBa dengan cars manual masih depat digunakan, sepanjang pendukung dan
spesimen, jenis spesimen dan pengolahan di laboratorium yang memenuhi
persyaratan bank sarana dan slat hingga media pengujian d*at dengan cara benar.
Berdasarkan hasil reaksi darn uji colour, uji terhadap genus, uji terhadap gula-gala
untuk spesies dan dieocokkan pada Tabel yang sudah bake.
UCAPAN TERIMA KASIH
Penulis mengucapkan banyak terima kasih kepada Bapak Drs. Bhakti
Puruvadikarta yang telah membantu pengusan makalah inn.
DAFI'AR PUSTAKA
1984. Manual of Systematic Bacteriology Vol.1, 1984. Williams &
WillQns Baltimore, London.
CARTER, G.R 1974 . Diagbnostics Procedure of Veterinary Microbiology, Sixth
edition.
COWAN , S.T. 1974. Manual of the Identification of Medical Bakteria. Second
edition . Cambridge University Press, London.
TOPLEY & WILSON. 1975. Principles of Bacteriology, Virology & Immunity. Sixth
edition. Vol.l, 1975. Edwar Arnold Ltd, London .
BERGEY'S .