metode - IPB Repository

4
Jaringan Lemak Ulat Sutera
Selama metamorfosis, jaringan lemak ulat sutera mengalami perubahan.
Jaringan lemak imago berasal dari beberapa sel lemak larva yang bertahan pada
masa pupa atau kepompong. Jaringan lemak pada fase pupa berbeda antara betina
dan jantan. Jaringan lemak lebih banyak ditemukan pada pupa betina dibandingkan
pupa jantan. Sebagian besar sel lemak pupa betina dimanfaatkan untuk pematangan
sel telur, sementara sebagian besar sel lemak pupa jantan dimanfaatkan sebagai
cadangan energi untuk bertahan hidup (Tajima 1978).
Bakteri pada Ulat Sutera
Beberapa jenis bakteri yang dapat menyebabkan penyakit pada ulat sutera
Bombyx mori telah dilaporkan. Menurut Sakthivel et al. (2012), bakteri yang
berhasil diisolasi dan diidentifikasi dari ulat sutera Bombyx mori yang sakit dapat
dilihat pada Tabel 1.
Tabel 1 Identifikasi bakteri pada ulat sutera Bombyx mori yang sakit (Sakthivel et
al. 2012).
No
1
2
3
4
5
6
7
Bakteri
Bacillus subtilis
Streptococcus pneumoniae
Staphylococcus aureus
Escherichia coli
Pseudomonas fluorescence
Bacillus cereus
Klebsiella cloacae
METODE
Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Januari 2014 sampai dengan Juli 2014.
Pemeliharaan imago ulat sutera liar A. atlas dilakukan di Laboratorium
Metabolisme Divisi Fisiologi Departemen Anatomi Fisiologi dan Farmakologi
Fakultas Kedokteran Hewan Institut Pertanian Bogor. Identifikasi bakteri dilakukan
di Laboratorium Riset Mikrobiologi Divisi Mikrobiologi Medik Departemen Ilmu
Penyakit Hewan dan Kesehatan Masyarakat Veteriner Fakultas Kedokteran Hewan
Institut Pertanian Bogor.
Alat dan Bahan
Alat-alat yang digunakan adalah kandang kasa ukuran 50 cm x 50 cm x 50
cm, cawan petri, lemari pendingin, alat bedah minor berupa gunting, scalpel, dan
5
pinset, botol 5 ml, ose, needle, gelas objek, tabung reaksi, cawan petri, pipet, rak
tabung reaksi, pembakar Bunsen, mikroskop cahaya, spidol, label nama, inkubator,
dan camera digital. Bahan-bahan yang digunakan adalah jaringan lemak imago
betina ulat sutera liar A. atlas sebanyak 5 ekor yang diambil di bagian toraks,
akuades steril, media untuk mengisolasi seperti agar darah, Mac Conkey Agar
(MCA), dan Trypticasein Soy Agar (TSA), media untuk mengidentifikasi bakteri
seperti Triple Sugar Iron Agar (TSIA), indol, kaldu gula-gula (glukosa, sukrosa,
manitol, maltosa, dan laktosa), zat warna Gram (kristal violet, lugol, aseton alkohol,
safranin), dan alkohol 70%.
Metode Penelitian
Pengambilan dan Pemeliharaan Kokon
Kokon ulat sutera A. atlas diambil dari perkebunan teh PTPN VIII Pangleujar
kabupaten Purwakarta provinsi Jawa Barat. Kokon disimpan dalam kandang kasa
berukuran 50 cm x 50 cm x 50 cm. Pemisahan antara kokon betina dan jantan
dengan cara kulit kokon digunting untuk melihat bakal imago jantan dan betina ulat
sutera A. atlas. Pupa yang memiliki antena yang besar akan menjadi imago jantan
sedangkan pupa yang memiliki antena kecil akan menjadi imago betina.
Pengambilan Sampel
Imago betina dimasukkan ke dalam freezer selama 60 menit sampai imago
mati. Kemudian imago dinekropsi dengan menggunakan seperangkat alat bedah
minor steril berupa pinset, scalpel, dan gunting. Bagian yang akan dinekropsi
disterilkan dahulu dengan alkohol 70 %. Setelah itu, dilakukan pengambilan
jaringan lemak menggunakan pinset dan dimasukkan ke dalam botol kaca yang
berisi akuades steril 2 ml. Sampel diambil dari 5 ekor imago ulat sutera liar A. atlas
di bagian toraks.
Isolasi Bakteri
Sampel diambil dengan menggunakan ose dan dibiakkan ke dalam media
agar darah dan MCA dengan goresan T dan diinkubasi selama 24 jam dalam
inkubator dengan suhu 37 oC. Setelah 24 jam, koloni terpisah dari bakteri yang
tumbuh pada media agar darah dan MCA dicatat ciri koloninya. Setiap koloni yang
tumbuh berbeda sepanjang goresan dibiakkan ke dalam agar miring TSA dan
dilakukan pelabelan untuk setiap koloni. Biakan agar miring TSA diinkubasi
selama 24 jam menggunakan inkubator dengan suhu 37 oC.
Identifikasi Bakteri
Koloni yang tumbuh pada media TSA diwarnai dengan pewarnaan Gram
untuk dilihat morfologi, sifat Gram, dan kemurniannya. Menurut Lay (1994),
preparat ulas ditetesi dengan larutan kristal violet dan didiamkan kurang lebih 60
detik. Preparat dibilas dengan akuades. Setelah dicuci, preparat ditetesi larutan
lugol selama 60 detik dan dibilas dengan akuades hingga bersih. Preparat diberi
larutan pemucat berupa aseton alkohol kurang lebih 15 detik dan dibilas kembali
dengan akuades hingga bersih. Preparat ditetesi larutan safranin kurang lebih 15–
20 detik dan dibilas kembali dengan akuades hingga bersih. Setelah itu, preparat
6
dikeringkan dengan kertas saring dan diamati di bawah mikroskop dengan
perbesaran objektif 100x yang sebelumnya ditetesi minyak emersi. Hasil
pewarnaan Gram, bakteri Gram positif berwarna ungu sedangkan bakteri Gram
negatif berwarna merah. Apabila terdapat koloni bakteri yang belum murni, maka
dilakukan kembali isolasi pada agar darah maupun MCA dengan goresan T.
Apabila hasil dari pewarnaan Gram kurang meyakinkan, maka dilakukan uji
KOH 3% untuk menentukan sifat Gram bakteri. Bakteri Gram negatif akan
memberikan hasil adanya masa gelatin yang membentuk benang-benang halus saat
diangkat menggunakan ose. Secara ringkas alur identifikasi bakteri Gram Positif
dan negatif dapat dilihat pada Gambar 2 dan 3. Identifikasi akhir mengacu pada
Jang et al. (1976), Barrow dan Feltham (1993), dan Bergey dan Breed (1994),
seperti tampak pada Gambar 2 dan 3.
Bakteri Gram
Negatif
Batang
kokus
(+)
(-)
Nonenterobacteri
aceae
Enterobacteriacea
e
Pseudomonas
Aeromonas
Vibrio
Neisseria
MacConkey Agar
Laktosa Negatif
TSIA
Indol
Sitrat
MRVP
Fermentasi
Karbohidrat
Laktosa Positif
TSIA
Indol
Sitrat
MRVP
Fermentasi
Karbohidrat
Gambar 2 Diagram alir identifikasi bakteri Gram Negatif
Sumber: Bergey dan Breed 1994; Lay 1994
7
Gambar 3 Diagram alir identifikasi bakteri Gram Positif
Sumber: Bergey dan Breed 1994; Lay 1994
Analisis Data
Analisis data dengan menggunakan metode deskriptif.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Isolasi Bakteri
Terdapat tiga koloni bakteri yang tumbuh pada media agar darah dan MCA
(Tabel 2). Koloni bakteri yang didapatkan pada media agar darah berukuran sedang,
berbentuk bulat, permukaan kasar, tidak mengkilat, tepi tidak rata, elevasi
cembung, berwarna krem ,dan hemolisis β. Satu koloni bakteri yang terbentuk pada