04. Validasi Mikrobiologi up date [Compatibility Mode]

8/4/2015
VALIDASI & VERIFIKASI
METODA MIKROBIOLOGI
M-BRIO Training Proprietary - dilarang menggandakan
Embrio Biotekindo
dalam bentuk apapun tanpa ijin tertulis dari
1
Penentu Kehandalan
Analisis Mikrobiologi
Metode Analisa
Peralatan
• Metode Standar
• Modifikasi
• Penyederhanaan
Analis/Pelaksana
• Neraca
• Pengetahuan
• LAF
• Ketrampilan/kompeten
• Pipet
• Ketelitian
• Inkubator
• Autoklaf
VALIDASI &
VERIFIKASI METODE
KALIBRASI
M-BRIO Training Proprietary - dilarang menggandakan
dalam bentuk apapun tanpa ijin tertulis dari
Embrio Biotekindo
TRAINING &
UJI
KOMPETENSI
1
8/4/2015
Jenis Metode Uji
Metode Standar : SNI, ASTM, ISO, dll
Metode Resmi : Farmakope, EPA, dll
Metode yang dikembangkan oleh organisasi
profesional yang memiliki reputasi nasional dan
internasional : AOAC, BAM
Metode Pustaka
In house methode
Metode Modifikasi
M-BRIO Training Proprietary - dilarang menggandakan
Embrio Biotekindo
dalam bentuk apapun tanpa ijin tertulis dari
3
Pemilihan Metode
Faktor yang menjadi pertimbangan :
Asal metode
Status metode
Apakah lab. menguasai teknologinya ?
Apakah SDM/Analis kompeten ?
Biaya & waktu yang dibutuhkan
Metode mudah diaplikasikan
Kondisi akomodasi & peralatan lab. memadai ?
M-BRIO Training Proprietary - dilarang menggandakan
dalam bentuk apapun tanpa ijin tertulis dari
Embrio Biotekindo
4
2
8/4/2015
Proses untuk mengkorfimasi bahwa
suatu metoda mempunyai unjuk kerja
yang konsisten, sesuai dengan apa
yang dikehendaki dalam penerapan
metode,,,,
Apa itu Validasi ???
M-BRIO Training Proprietary - dilarang menggandakan
Embrio Biotekindo
dalam bentuk apapun tanpa ijin tertulis dari
5
Kapan Validasi dilakukan ??
Metode
non standar
Reagent
Baru
VALIDASI
METODE
Menyederhanakan
Metode
In house
Method
Validasi harus dilakukan sebelum setiap metode non standar
digunakan secara RUTIN di Laboratorium
M-BRIO Training Proprietary - dilarang menggandakan
dalam bentuk apapun tanpa ijin tertulis dari
Embrio Biotekindo
6
3
8/4/2015
Mengapa dilakukan
Validasi ???
ISO/IEC 17025-2005, elemen 5.4 Metode uji &
Validasi metode.
Banyak lab. menggunakan metode uji dari manual
book/alat
bukan metode standar/resmi (SNI, ISO,
AOAC, BAM, USP,dll).
Lab. di daerah kesulitan mendapatkan reagensia/media
tertentu
biaya, ED singkat
memangkas metode
standar.
In house method sebagai alternatif yaitu dengan
memodifikasi metode standar.
Bukti metode baru dapat digunakan/diadopsi oleh Lab dengan
mengevaluasi kemampuan kinerja metode uji,,,
M-BRIO Training Proprietary - dilarang menggandakan
Embrio Biotekindo
dalam bentuk apapun tanpa ijin tertulis dari
7
Apa yang akan dibuktikan dalam Validasi ?
membuktikan bahwa metoda baru dapat
menghasilkan paling tidak hasil yang
sebanding dengan Metoda Standar yang
dikenal (Australian Standar, ISO standar,
BAM, AOAC method, dll).
mempunyai
tingkat
sensitifitas
&
spesifisitas yang sama & dapat diterapkan
dalam kisaran matrik contoh yang biasa
diterima laboratorium untuk pengujian
m.o.
M-BRIO Training Proprietary - dilarang menggandakan
dalam bentuk apapun tanpa ijin tertulis dari
Embrio Biotekindo
8
4
8/4/2015
Konfirmasi melalui pengujian dan
penyajian bukti bahwa persyaratan
yang telah ditetapkan telah di penuhi
Apa itu Verifikasi ???
M-BRIO Training Proprietary - dilarang menggandakan
Embrio Biotekindo
dalam bentuk apapun tanpa ijin tertulis dari
9
Apa yang akan dibuktikan
dalam Verifikasi ?
Membuktikan bahwa metoda
standar yang digunakan telah sesuai
dengan kriteria yang ditetapkan,,
Mempertimbangkan dan memastikan apakah
metode uji tersebut dapat dipakai atau tidak
M-BRIO Training Proprietary - dilarang menggandakan
dalam bentuk apapun tanpa ijin tertulis dari
Embrio Biotekindo
10
5
8/4/2015
METODA PENGUJIAN
mikrobiologi
Kuantitatif
Hitungan Cawan
- Pour plate
: TPC, Y&M, Coliform, Enterobacteriaceae
- Spread Plate : S.aureus, B.cereus
MPN
: Coliform, E.coli
Petrifilm
: TPC, Y&M, Coliform
dll
•Kualitatif
Isolasi
- Salmonella
- Vibrio Cholera
- L.monocytogenes
- dll
M-BRIO Training Proprietary - dilarang menggandakan
dalam bentuk apapun tanpa ijin tertulis dari
Embrio Biotekindo
11
Parameter Validasi & Verifikasi
Metode Uji
Kuantitatif
Presisi
Akurasi
Kualitatif
Sensitifitas
Spesifisitas
False Positif
False Negatif
Efficiency
M-BRIO Training Proprietary - dilarang menggandakan
dalam bentuk apapun tanpa ijin tertulis dari
Embrio Biotekindo
12
6
8/4/2015
Presisi
Kedekatan hasil antara beberapa hasil pengukuran ulang yang
diukur dengan cara yang sama.
Parameter :
Relatif Standar Deviasi
Koefisien Variasi
Repeatability
Waktu analisa, alat, penguji/analis sama dalam laboratorium yang
sama.
Intermediate Precision
Waktu analisa atau alat atau penguji/analis beda dalam
laboratorium yang sama (variasi inter laboratorium)
Reproducibility
Waktu analisa, alat, penguji/analis beda dalam laboratorium yang
berbeda.
M-BRIO Training Proprietary - dilarang menggandakan
dalam bentuk apapun tanpa ijin tertulis dari
Embrio Biotekindo
13
Presisi
RSD =
∑ ((Log a – log b) / x1)2
2n
CV (coefisien of variation) = RSD x 100%
Syarat :
RSD = max. 0,1 (ideal < 0,02)
CV = max.10 %
M-BRIO Training Proprietary - dilarang menggandakan
dalam bentuk apapun tanpa ijin tertulis dari
Embrio Biotekindo
14
7
8/4/2015
Akurasi
Kedekatan hasil analisis dengan nilai sebenarnya.
Parameter :
Recovery (Perolehan Kembali)
Teknik analisis yang dilakukan dengan menambahkan
kultur acuan pada konsentrasi tertentu dalam suatu
matriks contoh.
Perhitungan
H x 100 %
A
H = Hasil pengujian dengan metode (sample + spike) sample
A = Hasil sebenarnya dari MO target (spike)
Syarat : > 70 %
Catatan : Gunakan sample yang tidak mengandung MO
M-BRIO Training Proprietary - dilarang menggandakan
dalam bentuk apapun tanpa ijin tertulis dari
Embrio Biotekindo
15
Sensitifity : kemampuan metoda dalam
memberikan hasil positif terhadap sampel
yang positif
Spesificity : kemampuan metoda dalam
memberikan hasil negatif terhadap sampel
yang negatif
False positive rate : persentase jumlah sampel
yang salah identifikasi sebagai positif
False negative rate : persentase jumlah sampel
yang salah identifikasi sebagai negatif
Confidence limit :95 %
M-BRIO Training Proprietary - dilarang menggandakan
dalam bentuk apapun tanpa ijin tertulis dari
Embrio Biotekindo
16
8
8/4/2015
Tahapan Validasi/Verifikasi
Memilih Organisme Uji
Memilih matriks sample
Melakukan pengujian sesuai prosedur
Interpretasi hasil
M-BRIO Training Proprietary - dilarang menggandakan
dalam bentuk apapun tanpa ijin tertulis dari
Embrio Biotekindo
17
Syarat,,,,
Menggunakan
terkalibrasi
peralatan
yang
Dilakukan oleh personil yang kompeten
Media/Reagent yang digunakan sesuai
spesifikasinya.
Kondisi lingkungan memadai
M-BRIO Training Proprietary - dilarang menggandakan
dalam bentuk apapun tanpa ijin tertulis dari
Embrio Biotekindo
18
9
8/4/2015
Memilih Organisme Uji
Sesuai SR 02
- MO acuan berasal dari koleksi yang diakui
- Menjamin ketertelusuran
- Dipelihara oleh Penanggungjawab MO acuan
- Pemeliharaan sebagai berikut :
M-BRIO Training Proprietary - dilarang menggandakan
dalam bentuk apapun tanpa ijin tertulis dari
Embrio Biotekindo
19
Strain (ATCC, NTCC)
Subkultur sekali
*
Persediaan acuan
(Liofilisasi)
Dicairkan
Kultur kerja
*
(Penggunaan rutin)
* : uji kemurnian
M-BRIO Training Proprietary - dilarang menggandakan
dalam bentuk apapun tanpa ijin tertulis dari
Embrio Biotekindo
20
10
8/4/2015
Memilih Organisme Uji
3-5 strain untuk validasi dan min. 1 strain untuk
verifikasi dari organisme target.
Kultur acuan yang dinyatakan sebagai kontrol positif
harus merupakan salah satu dari strain tersebut.
Strain yang lain dipilih dari hal berikut :
Strain dari organisme target yang diisolasi oleh
laboratorium dari sampel terdahulu dalam matrik
yang diperiksa.
Strain dari organisme target yang dikumpulkan oleh
cultur collection.
M-BRIO Training Proprietary - dilarang menggandakan
dalam bentuk apapun tanpa ijin tertulis dari
Embrio Biotekindo
21
Memilih Matrik Sampel
Tujuan seleksi sampel adalah untuk memilih
sampel yang mewakili lingkup variasi yang
akan ditemui dalam matriks yang telah
ditentukan.
Dapat menggunakan sample yang tercemari
secara alami atau dapat menggunakan sample
yang dicemari (spike sample).
Perhatian harus diutamakan pada mendeteksi
jumlah dan homogenitas kontaminan.
M-BRIO Training Proprietary - dilarang menggandakan
dalam bentuk apapun tanpa ijin tertulis dari
Embrio Biotekindo
22
11
8/4/2015
Metode Spike Sample
Menghitung Populasi pada Biakan Murni
Hari ke 1
1 loop
Biakan murni
dalam agar
miring
Inkubasi selama
18-24jam pada
suhu 35-37 0C
BHIBroth/media
lainnya 10 ml
M-BRIO Training Proprietary - dilarang menggandakan
Embrio Biotekindo
dalam bentuk apapun tanpa ijin tertulis dari
23
Metode Spike Sample
Menghitung Populasi pada Biakan Murni
Hari ke 2
10-1
1 ml
BHI-Broth
10 ml
Hit. Jumlah
koloni/ml
10-2
1 ml
BPW 9 ml
10-3
1 ml
BPW 9 ml
Dst 10-7
.
1 ml
BPW 9 ml
10-8
1 ml
BPW 9 ml
10-9
1 ml
BPW 9 ml
BPW 9 ml
1 ml
Inkubasi selama 48
jam pada suhu 36±1 0C
M-BRIO Training Proprietary - dilarang menggandakan
dalam bentuk apapun tanpa ijin tertulis dari
Embrio Biotekindo
24
12
8/4/2015
Metode Spike Sample
Menghitung Populasi pada Biakan Murni
Hari ke 4
Menghitung jumlah bakteri dalam cawan petri
Ulangan
10-7
10-8
10-9
Hasil
1
241
24
3
2,4 x 109 kol/ml
2
238
22
2
M-BRIO Training Proprietary - dilarang menggandakan
Embrio Biotekindo
dalam bentuk apapun tanpa ijin tertulis dari
25
Persiapan matriks
Pipet 100 gr/ ml
sample
900 ml BPW
(Buffer Peptone Water)
Homogenisasi
Catatan,,,
Gunakan sample yang
tidak tercemari MO target
M-BRIO Training Proprietary - dilarang menggandakan
dalam bentuk apapun tanpa ijin tertulis dari
Embrio Biotekindo
26
13
8/4/2015
Pembuatan Spike Populasi Rendah
Dst
10-2 .
10-8
10-1
1 ml
BHI-Broth
10 ml
90 ml
sample
1 ml
BPW 9 ml
1 ml
BPW 9 ml
10 ml
BPW 9 ml
Didapatkan 1 : 10
spike sample
populasi rendah
(2 kol/ml atau/gr)
M-BRIO Training Proprietary - dilarang menggandakan
Embrio Biotekindo
dalam bentuk apapun tanpa ijin tertulis dari
27
Pembuatan Spike Populasi Sedang
Dst
10-2 .
10-7
10-1
1 ml
BHI-Broth
10 ml
90 ml
sample
1 ml
BPW 9 ml
1 ml
BPW 9 ml
10 ml
BPW 9 ml
Didapatkan 1 : 10
spike sample
populasi sedang
(2,0 x 101 kol/ml
atau/gr)
M-BRIO Training Proprietary - dilarang menggandakan
dalam bentuk apapun tanpa ijin tertulis dari
Embrio Biotekindo
28
14
8/4/2015
Pembuatan Spike Populasi Tinggi
10-1
1 ml
BHI-Broth
10 ml
10-2
1 ml
BPW 9 ml
BPW 9 ml
10-6
1 ml
BPW 9 ml
90 ml
sample
10
ml
Didapatkan 1 : 10
spike sample
populasi tinggi
(2,0 x102 kol/ml atau /gr)
M-BRIO Training Proprietary - dilarang menggandakan
dalam bentuk apapun tanpa ijin tertulis dari
Embrio Biotekindo
29
Prosedur Validasi & Verifikasi
Kuantitatif (Hitungan Cawan)
- Lakukan pengujian sedikitnya 15 kali
(perkiraan populasi pada contoh : rendah, sedang, tinggi)
- Lakukan juga sample tanpa diinokulasi (bila
menggunakan metode spike sample) atau tidak
mengandung organisme target.
- Hitung RSD dari masing-masing populasi dan gabungan
semua populasi.
Catatan. Jika dilakukan oleh analis berbeda, dapat dihitung presisi dari masingmasing analis untuk mengetahui kinerja analis
M-BRIO Training Proprietary - dilarang menggandakan
dalam bentuk apapun tanpa ijin tertulis dari
Embrio Biotekindo
30
15
8/4/2015
Kuantitatif MPN (Most Probable Number)
Kriteria
Sensitifity
Spesificity
False positive rate
False negative rate
Efficiency
Confidence limit :95 %
M-BRIO Training Proprietary - dilarang menggandakan
dalam bentuk apapun tanpa ijin tertulis dari
Embrio Biotekindo
31
Prosedur
Siapkan sampel (kontaminasi alami atau sengaja) sesuai
prosedur.
Inokulasi larutan contoh pada media atau tabung-tabung
pertumbuhan.
Hitung jumlah tabung yang positif dan negatif.
Konfirmasi dengan uji biokimia terhadap koloni yang
terdapat pada cawan atau setiap tabung yang positif dan
negatif.
Hitung Sensitifity, Spesificity, False Positif,
False
Negatif, dan Efficiency.
M-BRIO Training Proprietary - dilarang menggandakan
dalam bentuk apapun tanpa ijin tertulis dari
Embrio Biotekindo
32
16
8/4/2015
Konfirmasi
Validasi
Semua presumptive positive dan negative
harus dikonfirmasi
Verifikasi
Semua presumptive positive yang
dikonfirmasi
M-BRIO Training Proprietary - dilarang menggandakan
Embrio Biotekindo
dalam bentuk apapun tanpa ijin tertulis dari
33
Perhitungan
Confirmed
Presumtive
Positif
Negatif
Positif
A
(positive)
B
(false negative)
Negatif
C
(false positive)
D
(negative)
Sensitifitas = A/(A+B) x 100
Efficiency = (a+d)/n x 100
Spesifitas = D/(C+D) x 100
False positive rate = c/(a+c) x 100
False negatif rate = b/(b+d) x 100
Jumlah tabung : a + b + c + d = n
M-BRIO Training Proprietary - dilarang menggandakan
dalam bentuk apapun tanpa ijin tertulis dari
Embrio Biotekindo
34
17
8/4/2015
Kualitatif
Lakukan pengujian sedikitnya 10 kali
(perkiraan populasi pada contoh :
rendah dan tinggi)
- Lakukan juga sample tanpa
diinokulasi (bila menggunakan metode
spike sample) atau tidak mengandung
organisme target.
-Hitung Sensitifity, Spesificity, False
Positif, False Negatif, dan Efficiency
M-BRIO Training Proprietary - dilarang menggandakan
Embrio Biotekindo
dalam bentuk apapun tanpa ijin tertulis dari
35
Penghitungan Verifikasi
Confirmed
Presumtive
positif
negatif
A
(positive)
positif
negatif
C
(false positive)
B
(false
negative)
D
(negative)
Sensitifitas = A/(A+B) x 100
Spesifitas = D/(C+D) x 100
Jumlah contoh : a + b + c + d = n
False positive rate = c/(a+c)
Efficiency = (a+d)/n x 100
False negatif rate = b/(b+d)
M-BRIO Training Proprietary - dilarang menggandakan
dalam bentuk apapun tanpa ijin tertulis dari
Embrio Biotekindo
36
18
8/4/2015
Perhitungan Validasi
Confirmed
Metoda non standar
positif
negatif
positif
negatif
A
(positive)
B
(false negative)
C
(false positive)
D
(negative)
Sensitifitas = A/(A+B) x 100
Spesifitas = D/(C+D) x 100
False positive rate = c/(a+c) x 100
Jumlah contoh : a + b + c + d = n
Efficiency = (a+d)/n x 100
False negatif rate = b/(b+d) x 100
M-BRIO Training Proprietary - dilarang menggandakan
Embrio Biotekindo
dalam bentuk apapun tanpa ijin tertulis dari
37
Method Validation of Microbiological
Methods,
Guidance Note : C & B and ENV 002.
Singapore Acreditation Council,
July 2002
M-BRIO Training Proprietary - dilarang menggandakan
dalam bentuk apapun tanpa ijin tertulis dari
Embrio Biotekindo
38
19
8/4/2015
Kapan Validasi kultur Media
dilakukan ?
Kultur media diganti dengan media baru
(XLD Agar diganti dengan Rambach Agar)
Kultur media diganti dengan brand lain
(OXOID diganti dengan MERCK)
Kultur media diganti dengan non kultur test
(XLD diganti dengan Singlepath Salmonella)
Metode kultur diganti dengan metode lain
Mis. ELISA, PCR
39
Performance Kultur Media
Misalnya : media Baird Parker Agar untuk pengujian S.aureus
Reference media : TSA
Parameter
Strain
Uji
Kriteria
Karakteristik koloni
Produktivitas
S.aureus ATCC 25923
Kuantitatif
> 0,5
Black colonies with
lightening halo
Selektivitas
E.coli ATCC 25922
Kualitatif
Total
penghambat
-
S.epidermidis ATCC 12228
Kualitatif
-
Black colonies without
lightening halo
Elektivitas
PRoduktivitas = Test method
Reference method
Non Selektif : > 0.7
40
20
8/4/2015
The end…..
M-BRIO Training Proprietary - dilarang menggandakan
Embrio Biotekindo
dalam
ijin tertulis
dari menggandakan
Mbentuk
-BRIO apapun
Trainingtanpa
Proprietary
- dilarang
dalam bentuk apapun tanpa ijin tertulis dari
Embrio Biotekindo
16
41
21