Studi Seroprevalensi Infectious Bronchitis pada

METODOLOGI PENELITIAN
Waktu dan tempat penelitian
Penelitian ini dilakukan dalam dua tahap. Tahap I yaitu pengambilan
sampel pada ayam kampung yang dipelihara di area peternakan unggas sektor I
dan II dalam satu kompartemen peternakan unggas di Kecamatan Cipunegara,
Kabupaten Subang pada bulan Desember 2009. Tahap II yaitu pengujian
laboratorium di Laboratorium Terpadu dan Laboratorium Imunologi Departemen
Ilmu Penyakit Hewan dan Kesehatan Masyarakat Veteriner pada bulan Februari
2010 sampai Juni 2011.
Bahan dan alat
Bahan penelitian ini adalah sampel serum yang diperoleh dari ayam
kampung di lima desa di Kecamatan Cipunegara. Ayam yang diambil sampelnya
merupakan ayam kampung yang dipelihara di daerah kompartemen peternakan
unggas komersial sektor satu dan dua. Bahan-bahan lain adalah Antigen IBV tipe
M41 yang diperoleh dari Central Veterinary Institute (CVI) Lelystad the
Netherland, suspensisel darah merah 1%, Phosphate Buffer Saline (0.01 M) pH
7.0-7.2, kontrol positif serum dan kontrol negatif serum. Alat yang digunakan
dalam penelitian ini antara lain mikro pipet, microplate berdasar V, timer dan
shaker.
Penyiapan suspensi sel darah merah 1%
Darah utuh (whoole blood) ayam dewasa sehat ditambahkan antikoagulan
Na Sitrat 3.8% dengan perbandingan 4:1. Darah dipisahkan dari Na Sitrat dengan
cara disentrifugasi 1500 G selama 10 menit. Hasil sentrifugasi dibuang
supernatannya dan diambil endapannya yang merupakan sel darah merah.
Selanjutnya endapan dicuci dengan menambahkan NaCl fisiologis sebanyak dua
volume sel darah merah kemudian disentrifugasi kembali dengan pada kecepatan
dan waktu yang sama seperti di atas. Pencucian dilakukan sebanyak tiga kali, hasil
pencucian sel darah merah merupakan suspensi sel darah merah 100%. Suspensi
sel darah merah diencerkan bertingkat menjadi 50% kemudian diencerkan
kembali menjadi 5%. Suspensi sel darah merah tersebut bisa langsung digunakan
dengan diencerkan terlebih dahulu menjadi suspensi 1% untuk uji haemaglutinasi
inhibisi mikrotitrasi.
Prosedur penyiapan virus standar dengan haemagglutination (HA) test (OIE
2009)
1.
PBS sebanyak 25 µl dimasukkan ke plate berdasar V baris pada A sampai
E, kolom dua sampai 12.
2.
Selanjutnya antigen IB sebanyak 50 µl dimasukkan ke sumur A1 sampai E1.
3.
Antigen IB sebanyak 25 µl dipindahkan dari sumur A1 sampai E1 ke dalam
sumur A2 sampai E2 menggunakan multichanelpipet. Setiap memasukkan
antigen dilakukan penggantian tips.
4.
Sebanyak 25 µl PBS dimasukkan ke dalam sumur B2 dan dihomogenkan 10
kali dengan memipet naik dan turun. Selanjutnya dari sumur B2 dikeluarkan
sebanyak 25 µl campuran tersebut sehingga pengenceran pada sumur B2
menjadi 1/3.
5.
PBS sebanyak 75 µl dimasukkan ke dalam sumur C2 dan dihomogenkan 10
kali dengan cara memipet naik dan turun. Dari sumur C2 diambil 75 µl
campuran pada sumur tersebut sehingga pengencerannya menjadi 1/5.
6.
PBS sebanyak 125 µl dipipet ke dalam sumur D2 dan dihomogenkan 10 kali
dengan cara memipet naik dan turun. Dari sumur D2 diambil 125 µl
suspensi sehingga pengenceran pada sumur tersebut menjadi 1/7.
7.
PBS sebanyak 175 µl dipipet ke dalam sumur E2 dan dihomogenkan 10 kali
dengan cara memipet naik dan turun. Dari sumur E2 diambil 175 µl
suspensi sehingga pengenceran pada sumur tersebut menjadi 1/9.
8.
Selanjutnya digunakan multichanelpipet dengan tips baru. Dipipet 25 µl
suspensi dari kolom A2 sampai E2 ke dalam A3 sampai E3 dan
dihomogenkan 5 kali dengan cara memipet ke atas dan ke bawah. Dipipet
dengan tips yang sama 25 µl suspensi dari kolom A3 sampai E3 ke dalam
kolom A4 sampai E4 dan dihomogenkan 5 kali dengan memipet naik dan
turun. Langkah ini diulangi hingga kolom A12 sampai E12. Setelah
dihomogenkan 5 kali dari A12 sampai E12 dibuang 25 µl suspensi.
9.
Selanjutnya dimasukkan sebanyak 25 µl PBS ke dalam setiap sumur.
10.
Terakhir ditambahkan 25 µl sel darah merah (1% v/v) ke dalam setiap
sumur. Plate dikocok selama 10 detik.
11.
Kemudian plate diinkubasi selama 60 menit pada suhu 4 oC.
Prosedur Haemagglutination Inhibition (HI) Test
1.
PBS sebanyak 0.025 ml dimasukkan ke setiap sumur microplate plastik
berdasar V, kemudian ditambahkan 0.025 ml serum ke dalam sumur
pertama dari plate. Setiap sampel diuji dua kali.
2.
Serum pada
sumur
pertama dihomogenkan dengan menggunakan
mikropipet dan dipindahkan ke sumur kedua. Selanjutnya dilakukan
pemindahan sampai sumur ke-12.
3.
Antigen standar virus IB bertiter 4 HAU selanjutnya ditambahkan sebanyak
0.025 ml pada setiap sumur, kemudian dikocok selama 10 detik dan
diinkubasi selama 60 menit dengan suhu 4 oC.
4.
Plate yang telah diinkubasi kemudian ditambahkan sel darah merah (1%
v/v) pada setiap sumur dan dikocok selama 10 detik. Selanjutnya plate
diinkubasi selama 60 menit dengan suhu 4 oC. Berikutnya diamati adanya
penghambatan aglutinasi dengan membandingkan terhadap serum kontrol.