Templat tugas akhir S1

ANALISIS INTEGRASI GEN PEROKSIDASE (PerL) DAN
PEWARISAN GEN hpt PADA TANAMAN TEMBAKAU
(Nicotiana tabacum) KULTIVAR SR1 TRANSGENIK
ZANI UMAMI
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2016
PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Analisis Integrasi Gen
Peroksidase (PerL) dan Pewarisan Gen hpt pada Tanaman Tembakau (Nicotiana
tabacum) Kultivar SR1 Transgenik adalah benar karya saya bersama dengan komisi
pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apapun kepada perguruan tinggi
manapun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan
maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan
dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor.
Bogor, Januari 2016
Zani Umami
NIM G34110010
ABSTRAK
ZANI UMAMI. Analisis Integrasi dan Stabilitas Gen Peroksidase (PerL)
pada Tanaman Tembakau (Nicotiana tabacum) Kultivar SR1 Transgenik.
Dibimbing oleh UTUT WIDYASTUTI dan SUHARSONO.
Peroksidase merupakan salah satu enzim yang bekerja dalam sistem
pertahanan diri tumbuhan. Gen peroksidase dari kedelai kultivar Lumut (PerL)
yang dipautkan dengan gen hpt telah diintroduksikan ke tanaman tembakau
(Nicotiana tabacum) kultivar SR1 sehingga menghasilkan tanaman transgenik.
Penelitian ini bertujuan untuk menganalisis integrasi gen PerL dan pewarisan gen
hpt pada tanaman tembakau (N.tabacum) kultivar SR1 transgenik putatif. Analisis
integrasi menggunakan PCR (Polymerase Chain Reaction) dilakukan untuk
mengkonfirmasi keberhasilan integrasi gen PerL di dalam genom tanaman
transgenik. Analisis integrasi PerL menggunakan primer 35S-F dan Atprx-R
menunjukkan bahwa 6 tanaman transgenik putatif generasi pertama (T0)
mengandung gen PerL di bawah kendali promotor 35S CaMV. Analisis segregasi
transgen dengan Khi-kuadrat menunjukkan bahwa gen hpt yang dipautkan dengan
gen PerL diwariskan ke N. tabacum transgenik generasi kedua (T1) namun tidak
mengikuti pola segregasi Mendel untuk satu atau dua gen bebas. Hal ini
mengindikasikan terjadinya lebih dari dua kopi gen yang terintegrasi di dalam
genom tanaman.
Kata kunci: gen perL, kultivar SR1, Nicotiana tabacum, stabilitas gen
ABSTRACT
ZANI UMAMI. Analysis of Peroxidase (PerL) Gene Integration and Inheritance of
hpt Gene in Transgenic Tobacco Plants (Nicotiana tabacum L.) Cultivar SR1.
Supervised by UTUT WIDYASTUTI and SUHARSONO.
Peroxidase is an important enzyme for plant defense. A peroxidase gene
isolated from soybean cv. Lumut (PerL) linked to hpt gene was introduced into
tobacco plant (Nicotiana tabacum) cultivar SR1 and resulted transgenic plants. The
aim of this research was to analyze the integration of PerL gene and inheritance of
hpt gene in putative transgenic N. tabacum cultivar SR1. Integration analysis by
PCR (Polymerase Chain Reaction) using 35S-F and Atprx-R primers showed that
six putative transgenic lines contain PerL gene under the control of 35S CaMV
promoter. The segregation analysis using chi-square test showed that the hpt gene
linked to PerL gene was inherited into the second generation (T1) of transgenic N.
tabacum without following the Mendelian segregation pattern for one or two genes.
This result indicated that more than two copies of gene were integrated into the
genome of transgenic plants.
Keywords: cultivar SR1, gene stability, Nicotiana tabacum, PerL gene
ANALISIS INTEGRASI GEN PEROKSIDASE (PerL) DAN
PEWARISAN GEN hpt PADA TANAMAN TEMBAKAU
(Nicotiana tabacum) KULTIVAR SR1 TRANSGENIK
ZANI UMAMI
Skripsi
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains
pada
Departemen Biologi
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2016
PRAKATA
Alhamdulillahirabbilalamin,
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah swt. atas segala karunia-Nya
sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Penelitian yang dilaksanakan sejak
Januari hingga Juli 2015 ini berjudul Analisis Integrasi dan Stabilitas Gen
Peroksidase (PerL) pada Tanaman Tembakau (Nicotiana tabacum) Kultivar SR1
Transgenik. Penelitian ini merupakan bagian dari kegiatan Hibah Penelitian
Unggulan Perguruan Tinggi DIKTI 2014 atas nama Dr Ir Utut Widyastuti, MSi
dengan judul “Perbaikan Genetik Tumbuhan Kedelai terhadap Cekaman Asam
melalui Teknik DNA Rekombinan Gen Antioksidan GST (Glutathione STransferase)
dan
Per
(Peroksidase)”
dengan
nomor
kontrak:
79/IT3.41.2/L1/SPK/2014.
Penulis menyadari bahwa tanpa bantuan dan bimbingan dari berbagai pihak,
sulit bagi penulis menyelesaikan karya ilmiah ini. Oleh karena itu, penulis
mengucapkan terima kasih kepada Ibu Dr Ir Utut Widyastuti, MSi selaku dosen
pembimbing pertama dan Prof Dr Ir Suharsono, DEA selaku dosen pembimbing
kedua, yang telah menyediakan waktu, pikiran, dan tenaga untuk mengarahkan
penulis dalam proses penelitian dan penyusunan karya ilmiah ini. Merupakan suatu
kebanggaan bagi penulis memiliki kesempatan untuk mengenal beliau dan
memperoleh masukan serta dukungan dalam proses penelitian, penyusunan, hingga
pengujian karya ilmiah penulis. Terima kasih kepada Ibu Prof Dr Dra Anja
Meryandini, MS sebagai dosen penguji yang telah memberi masukan terhadap
karya ilmiah penulis. Terima kasih kepada seluruh staf laboratorium BIORIN dan
BMST, khususnya Ibu Pepi Elvavina, Ibu Nia Dahniar, Bapak Abdul Mulya, Teh
Ara, Pak Asep, dan Pak Iri selaku teknisi yang telah memfasilitasi dan memberikan
bantuan. Terima kasih kepada Bapak Prof Dr Alex Hartana dan Pak Prass yang
telah memberikan izin penggunaan laboratorium sehingga memudahkan proses
penelitian. Terima kasih kepada senior yang telah membantu mengarahkan, Bu Ifa,
Mba Destik, Mba Fajri, Mba Seni, Mba Nurul, Kak Lutfi, Kak Icha, Kak Eka, Ka
Ika M., dan yang tidak bisa disebutkan satu per satu; teman seperjuangan yang
selalu bersedia direpotkan Amanda dan Santi, serta teman-teman yang selalu ada
sebagai tempat bertanya dan bertukar informasi Adit, Adzkiy, Zakiyya, Silmi,
Nurul, Budi, Dina, Kiki; serta Mario Muhammad sebagai senior sekaligus sahabat
yang memberikan semangat dan dukungan. Terima kasih tak terlupakan kepada
Bagus Prasetyo yang telah bersedia menemani, memberikan bantuan, perhatian,
dan dukungan, serta mendengarkan keluh kesah selama perjuangan penyelesaian
tugas akhir. Terima kasih kepada orang tua dan kakak-kakak tersayang yang telah
memberikan dukungan emosional, materi, dan moral untuk keberlangsungan studi;
saudara kembar penulis, Ayu Wingkis, yang selalu memberi semangat dan
mendampingi pengerjaan tugas akhir.
Penulis berharap semoga tulisan ini bermanfaat dan dapat memberikan
sumbangan bagi perkembangan ilmu pengetahuan.
Bogor, Januari 2016
Zani Umami
DAFTAR ISI
DAFT/AR TABEL
viii
DAFTAR GAMBAR
viii
DAFTAR LAMPIRAN
viii
PENDAHULUAN
1
Latar Belakang
1
Tujuan Penelitian
2
BAHAN DAN METODE
2
Tempat dan Waktu
2
Bahan
2
Metode Penelitian
2
Analisis integrasi gen PerL pada N. tabacum generasi T0
2
Analisis pewarisan gen hpt pada N. tabacum generasi T1
3
HASIL DAN PEMBAHASAN
4
Analisis Integrasi Gen PerL pada Tanaman T0 N. tabacum SR1
4
Analisis Pewarisan Gen hpt pada Tanaman T1 N. tabacum SR1
5
SIMPULAN
8
SARAN
8
DAFTAR PUSTAKA
8
LAMPIRAN
11
RIWAYAT HIDUP
17
DAFTAR TABEL
1 Nilai Khi-kuadrat pada uji 1 dan 2 gen bebas pada biji T1 N. tabacum 7
DAFTAR GAMBAR
1 Posisi gen PerL pada plasmid rekombinan pGWB502-PerL
3
2 Analisis integrasi gen 35S-PerL dengan PCR dari tanaman generasi
T0
4
3 Karakteristik kecambah transgenik dan non transgenik di media seleksi
mengandung higromisin
5
4 Pertumbuhan biji non transgenik (NT) dan transgenik (T) di media MS
tanpa higromisin
5
5 Pertumbuhan tanaman transgenik yang resisten terhadap higromisin di
media MS tanpa antibiotik
7
DAFTAR LAMPIRAN
1
2
3
4
5
6
7
8
Komposisi Media MS (Murashige and Skoog) 1x
Komposisi larutan penyangga TAE 50x dan 1x
Pertumbuhan biji transgenik di media MS mengandung higromisin
Pertumbuhan enam galur tanaman transgenik resisten higromisin di
media MS tanpa higromisin
Perhitungan uji Khi-kuadrat (χ2) untuk rasio 3:1
Perhitungan uji Khi-kuadrat (χ2) untuk rasio 9:7
Perhitungan uji Khi-kuadrat (χ2) untuk rasio 13:3
Perhitungan uji Khi-kuadrat (χ2) untuk rasio 15:1
11
11
12
12
13
13
14
15
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Tanaman memiliki sistem pertahanan diri yang berkaitan dengan proses
fisiologis ketika menghadapi suatu cekaman. Cekaman tertentu yang menyerang
sistem pertahanan diri tanaman dapat menginduksi ekspresi gen, salah satunya
adalah gen penyandi enzim peroksidase. Enzim peroksidase memiliki kemampuan
mengurai hidrogen peroksida (H2O2) menjadi air (Vicuna et al. 2011). Senyawa
H2O2 yang terbentuk dari pemecahan radikal superoksida (O2_) oleh superoksida
dismutase (SOD) merupakan reactive oxygen spesies (ROS) yang menyebabkan
kerusakan sel tanaman (Badawi et al. 2004). Pentingnya keberadaan enzim
peroksidase tersebut di dalam tanaman digunakan sebagai dasar untuk studi gen
Peroksidase. Gen Peroksidase yang berasal dari tanaman kedelai kultivar Lumut
yang disebut PerL telah berhasil diisolasi dan mengandung sekitar 1100 pb yang
memiliki domain asam amino terkonservasi pada cDNA PerL (Amirullah 2008).
Transformasi genetik umum dilakukan pada tanaman tembakau karena
tanaman tembakau telah lama digunakan sebagai tanaman model dalam penelitian
yang berhubungan dengan transformasi tumbuhan, ekspresi gen, dan stabilitas gen
(Ganapathi et al. 2004). Gen target yang diintegrasikan ke dalam genom tanaman
memerlukan promoter kuat agar gen dapat diekspresikan secara berlebih, yaitu
promoter 35S yang berasal dari Caulifower Mozaic Virus (35S CaMV). Ekspresi
gen target di dalam genom tanaman diketahui dengan digunakannya penanda
seleksi yang mampu menyeleksi tanaman transforman pada media dengan
penambahan antibiotik tertentu.
Gen PerL dengan kendali promoter 35S CaMV dan membawa gen penanda
seleksi berupa hygromycin phosphotransferase (hpt) telah berhasil diintroduksikan
ke dalam genom tanaman tembakau (Nicotiana tabacum) kultivar SR1 oleh
Wulandari (2014). Transformasi genetik tanaman tembakau melalui perantara
Agrobacterium tumefaciens tersebut menghasilkan beberapa tanaman transgenik
putatif yang resisten terhadap higromisin. Keberhasilan transformasi genetik telah
dibuktikan melalui analisis integrasi gen di dalam genom tanaman menggunakan
PCR, namun analisis tersebut baru dilakukan pada satu nomor tanaman sehingga
perlu dilakukan analisis integrasi gen pada tanaman transgenik putatif yang lain.
Tanaman hasil transformasi yang positif membawa transgen akan mewariskan gen
yang diintroduksikan ke generasi selanjutnya, yang pada umumnya mengikuti
Hukum Mendel (Horsch et al. 1984, Budar et al. 1986). Namun demikian, ada pula
kemungkinan terjadinya pewarisan transgen yang tidak mengikuti Hukum Mendel
(Deroles and Gardner 1988). Oleh sebab itu, analisis pewarisan transgen perlu
dilakukan untuk mengetahui stabilitas integrasi transgen di dalam genom melalui
pengamatan fenotip keturunan selanjutnya pada media yang mengandung agen
seleksi higromisin. Karena di dalam peta konstruksi gen PerL difusikan dengan gen
hpt yang menyandi resistensi higromisin (Wulandari 2014), maka analisis
pewarisan gen PerL dapat dilakukan melalui analisis pewarisan gen hpt.
2
Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk menganalisis integrasi gen peroksidase (PerL)
di dalam genom tanaman tembakau transgenik putatif (Nicotiana tabacum) kultivar
SR1 dan menganalisis pewarisan gen hpt pada generasi kedua melalui analisis
resistensi terhadap antibiotik higromisin.
BAHAN DAN METODE
Tempat dan Waktu
Penelitian dilakukan di Laboratorium Kultur Jaringan dan Laboratorium
BIORIN (Biotechnology Research Indonesian – The Netherlands) Pusat Penelitian
Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi (PPSHB) IPB. Penelitian dimulai dari bulan
Januari sampai dengan Juli 2015.
Bahan
Bahan tanaman yang digunakan adalah enam galur tanaman tembakau
kultivar SR1 transgenik putatif (Nt-PerL-1, Nt-PerL-2, Nt-PerL-3, Nt-PerL-4, NtPerL-5, Nt-PerL-6) hasil transformasi genetik (Wulandari 2014). Tanaman
transgenik putatif berasal dari beberapa kalus yang tumbuh pada media seleksi
higromisin (30mg/l). Galur Nt-PerL-6 merupakan galur tanaman transgenik yang
telah dianalisis mengandung gen PerL dan digunakan sebagai kontrol verifikasi
bagi tanaman putatif transgenik lainnya.
Bahan lain yang digunakan adalah media Murashige and Skoog (MS)
(Lampiran 1) sebagai media pertumbuhan tanaman in vitro dan media MS
mengandung higromisin konsentrasi 30 mg/l sebagai media seleksi.
Metode Penelitian
Analisis integrasi dan pewarisan transgen ke generasi berikutnya dilakukan
terhadap enam galur tanaman tembakau (N. tabacum). Integrasi gen PerL di dalam
genom tanaman transgenik generasi T0 dianalisis melalui teknik PCR (Polymerae
Chain Reaction), sedangkan analisis pewarisan transgen pada generasi T1
dilakukan dengan menggunakan gen penanda seleksi hpt. Pengujian hipotesis
terhadap segregasi menggunakan uji Khi-kuadrat.
Analisis integrasi gen PerL pada N. tabacum generasi T0
DNA tanaman tembakau transgenik putatif diisolasi dari daun
menggunakan metode CTAB (Doyle and Doyle 1987). Analisis integrasi gen
dilakukan menggunakan PCR dengan pasangan primer spesifik untuk gen PerL
yaitu primer 35S-F (5’-AAA CCT CCT CGG ATT CCA TT-3’) dan primer AtprxR (5’-GTT CTG AAG TAA ACG TCT TGA GAG-3’). Posisi kedua primer
tersebut di dalam vektor ekspresi disajikan pada Gambar 1. Selain itu, analisis gen
aktin juga dilakukan dengan pasangan primer aktin tembakau forward dan reverse
sebagai kontrol internal.
3
Gambar 1 Posisi gen PerL pada plasmid rekombinan pGWB502-PerL. RB: right
border, LB: left border, 35S-P: promoter 35S CaMV, PerL: gen
penyandi peroksidase dari kedelai kultivar lumut, HPT: hygromycin
phosphotransferase, Tnos dan Pnos: terminator dan promoter nopaline
synthase (Digambar ulang dari Wulandari (2014))
Larutan mix PCR dengan total volume 10 µl terdiri atas 1 µl template DNA
(konsentrasi 100 ng), Master Mix (KAPA2G) sebanyak 5 µl, primer F (forward)
dan primer R (reverse) masing-masing 0.25 µl (konsentrasi 10 pmol), dan 3.5 µl
ddH2O. Kondisi yang digunakan untuk pradenaturasi yaitu 94 oC selama 5 menit,
siklus PCR sebanyak 35 siklus pada kondisi 94 oC selama 1 menit, 55 oC selama 30
detik, dan 72 oC selama 1 menit, serta kondisi post extension pada 72 oC selama 7
menit. Mesin PCR yang digunakan yaitu Applied Biosystems 2720 Thermal Cycler.
Sampel hasil PCR dimigrasikan di gel agarosa menggunakan elektroforesis dengan
buffer TAE 1X (Lampiran 2) pada tegangan 100 volt selama 30 menit.
Analisis pewarisan gen hpt pada N. tabacum generasi T1
Tanaman tembakau transgenik generasi T0 yang membawa gen 35S-PerL
diaklimatisasi hingga menghasilkan biji T1. Proses aklimatisasi tanaman dilakukan
dengan cara pemindahan tanaman dari media MS ke arang sekam dan disimpan di
ruang kultur (25 oC) selama 3 hari. Setelah 3 hari, tanaman kemudian dipindahkan
ke suhu lapang (±30oC). Sungkup tanaman berupa gelas plastik dibuka secara
langsung setelah 2 hari, kemudian media arang sekam disiram secukupnya secara
teratur setiap hari. Dua minggu kemudian, tanaman dipindahkan ke media
campuran tanah dan arang sekam (1:1 b/b) di dalam polybag berukuran 20 cm.
Tanaman dirawat dengan pemberian pupuk Phonska (5 gram untuk setiap tanaman)
setiap 3 minggu terhitung sejak minggu pertama setelah tanam (MST), kemudian
diamati pertumbuhannya hingga berbunga dan berbiji. Calon bunga yang telah
muncul pada tanaman dewasa disungkup dengan kelambu untuk memastikan
terjadinya penyerbukan sendiri (self pollination).
Analisis pewarisan gen hpt dilakukan dengan menumbuhkan biji T1 yang
kering dan steril pada media seleksi MS yang mengandung 30 mg/l higromisin.
Sterilisasi biji dilakukan menggunakan alkohol 70% selama 30 detik, selanjutnya
dengan bayclin (5.25% NaClO) 100% selama 5 menit, dan dibilas dengan air steril
hingga cairan tidak berwarna coklat. Biji kemudian dikeringkan di dalam oven pada
suhu 40ºC. Biji yang telah ditanam di media seleksi (MS mengandung higromisin)
kemudian disimpan dalam ruang kultur bersuhu 23oC. Pengamatan tanaman
terhadap ketahanan higromisin diamati setiap minggu selama 2 bulan dengan
membandingkan terhadap kontrol. Kontrol yang digunakan adalah biji tanaman
non-transgenik yang ditumbuhkan pada media seleksi MS yang mengandung
higromisin. Pola pewarisan gen hpt diuji dengan Khi-kuadrat untuk menentukan
rasio segregasi gen pada kecambah T1 tembakau transgenik dengan rumus:
4
χ2 = ∑
(𝑜 − 𝑒)2
𝑒
Keterangan:
o : nilai observasi
e : nilai harapan
HASIL DAN PEMBAHASAN
Analisis Integrasi Gen PerL pada Tanaman T0 N. tabacum SR1
Analisis molekuler yang dilakukan dengan analisis integrasi transgen pada
genom tanaman dengan pasangan primer 35S-F dan Atprx-R melalui amplifikasi
DNA menunjukkan pita DNA berukuran 1500 pb pada keenam galur N. tabacum
generasi T0 (setara dengan F1), sedangkan tanaman non transgenik tidak
menghasilkan pita DNA (Gambar 2a). Hasil ini menunjukkan bahwa gen PerL telah
terintegrasi di dalam genom tanaman N. tabacum SR1 transgenik. Pada tanaman
non transgenik, amplifikasi dengan primer yang sama tidak menghasilkan adanya
pita DNA karena urutan nukleotida primer 35S tidak dimiliki oleh tanaman non
transgenik. Tidak adanya amplikon pada tanaman non transgenik bukan karena
tidak adanya DNA tanaman non transgenik. Hal ini dibuktikan dari hasil
amplifikasi DNA aktin tanaman non transgenik menggunakan pasangan primer
aktin (Act-F dan Act-R) yang spesifik pada tanaman tembakau menunjukkan
adanya pita DNA (Gambar 2b).
M
1
2
3
4
5
6
7
8
(a)
1500 bp
1500 bp
1000 bp
(b)
M
k-
1
2
3
4
5
6
7
Gambar 2 Analisis integrasi gen 35S-PerL dengan PCR dari tanaman generasi T0.
(a) dengan pasangan primer 35S-F dan Atprx-R, (b) dengan pasangan
primer Act-F dan Act-R. M) marker 1kb, 1) tanaman non-transgenik, 2)
tanaman Nt-PerL-1, 3) tanaman Nt-PerL-2, 4) tanaman Nt-PerL-3, 5)
tanaman Nt-PerL-4, 6) tanaman Nt-PerL-5, 7) tanaman Nt-PerL-6, 8)
plasmid pGWB502-PerL (kontrol positif). k- air
Analisis integrasi transgen selalu dilakukan pada tanaman transgenik putatif.
Selain pada tanaman tembakau analisis integrasi transgen juga dilakukan terhadap
tanaman lain hasil dari transformasi genetik, diantaranya tanaman kentang (Kashani
et al. 2012), tomat dan Arabidopsis (Cobb 2008), jagung (Gould et al. 1990), dan
padi (Maneewan et al. 2005). Integrasi transgen pada tanaman transgenik
diperlukan untuk memastikan keberadaan transgen di dalam genom tanaman hasil
5
transformasi dengan pemanfaatan teknik PCR (Kohli et al 2010) sehingga tanaman
generasi berikutnya yang mengandung transgen dapat diketahui.
Untuk memperkuat bukti integrasi gen diperlukan adanya kontrol internal
yang salah satunya dilakukan dengan pengecekan gen aktin yang spesifik pada
tanaman tertentu. Aktin memiliki fungsi esensial dalam kaitannya dengan
pembentukan struktur sitoskeleton sel (Thellin et al. 1999) dan aktin dapat
digunakan sebagai kontrol internal karena merupakan housekeeping gene yang
ekspresinya tidak berubah akibat perlakuan atau kondisi percobaan tertentu (Lin
and Redies 2012).
Analisis Pewarisan Gen hpt pada Tanaman T1 N. tabacum SR1
Biji T1 (setara dengan F2) tanaman N. tabacum SR1 transgenik (Gambar 3a,
3b, 3c) dan non transgenik (Gambar 3d) mampu berkecambah pada media seleksi
yang mengandung higromisin (Gambar 3). Tanaman T1 yang resisten (tahan)
terhadap higromisin memiliki karakter kecambah yang tumbuh dan berkembang
dengan warna hijau (Gambar 3a) dan kuning kecokelatan (Gambar 3b), sedangkan
tanaman yang sensitif (tidak tahan) terhadap higromisin hanya mampu
berkecambah membentuk kotiledon dan mengalami perubahan warna menjadi
kuning kecokelatan (Gambar 3c). Biji tanaman tembakau transgenik dan nontransgenik yang ditanam memiliki viabilitas yang baik dengan ciri pertumbuhan
akar dan daun di media MS tanpa higromisin (Gambar 4).
a)
b)
c)
d)
Gambar 3 Karakteristik kecambah Nt-PerL-2 transgenik (a, b, c) dan nontransgenik (d) di media seleksi yang mengandung 30 mg/l higromisin
selama 2 bulan setelah tanam. Kotiledon ditandai dengan tanda panah
( ); kecambah resisten dengan kotiledon tumbuh dan berkembang
dengan warna a) hijau dan b) kuning kecokelatan; c) kecambah sensitif
dengan kotiledon kuning kecokelatan; d) kecambah tanaman nontransgenik dengan kotiledon cokelat
Gambar 4 Pertumbuhan biji non-transgenik (NT) dan transgenik (T) di media MS
tanpa higromisin
6
Kelima populasi tanaman T1 memiliki kemampuan berkecambah yang
sama ketika ditumbuhkan pada media seleksi mengandung higromisin (Lampiran
3). Resistensi tanaman terhadap higromisin dipengaruhi oleh keberadaan gen hpt
yang difusikan dengan gen PerL ke dalam genom tanaman (Gambar 1). Keberadaan
gen hpt yang menyandi hygromycin phosphotransferase menyebabkan antibiotik
higromisin tidak toksik bagi tanaman. Hal tersebut disebabkan oleh kemampuan
hygromycin phosphotransferase dalam memfosforilasi gugus hidroksil dari
antibiotik higromisin (Brasileiro and Aragou 2001). Higromisin merupakan
antibiotik yang dapat menghambat sintesis protein dengan cara mengganggu proses
pemanjangan polipeptida dan menyebabkan kesalahan pembacaan mRNA pada
proses translasi (Gonzales et al. 1978).
Tanaman T1 yang diklasifikasikan sebagai tanaman yang tahan dan tidak
tahan terhadap higromisin berdasarkan fenotip kecambah dihitung sebagai data
analisis segregasi gen. Hasil segregasi yang diperoleh dibandingkan dengan pola
segregasi Mendel dengan menggunakan asumsi terdapat satu atau dua kopi gen hpt
dengan menggunakan Khi-kuadrat. Uji Khi-kuadrat dilakukan dengan
menggunakan derajat bebas satu dan nilai kesalahan 5%. Perhitungan uji Khikuadrat dengan perbandingan 3:1, 9:7, 13:3 dan 15:1, secara berurutan disajikan
pada Lampiran 5, 6, 7, dan 8. Hasil analisis segregasi gen hpt dengan uji Khikuadrat disajikan pada Tabel 1.
Uji Khi-kuadrat menunjukkan bahwa pewarisan gen hpt pada kelima galur
tanaman tembakau transgenik tidak menunjukkan satu atau dua gen yang
terintegrasi ke dalam genom. Integrasi multi gen yang terjadi dapat disebabkan oleh
karakter Agrobacterium tumefaciens yang digunakan sebagai agen perantara
(vektor) dengan karakteristik mengintegrasikan gen ke tanaman secara acak (Gelvin
2003) sehingga dapat menyebabkan lebih dari satu kopi gen yang terintegrasi ke
dalam genom N. tabacum L. SR1 transgenik. Penyimpangan rasio segregasi gen
yang tidak sesuai dengan segregasi Mendel untuk satu maupun dua gen bebas tidak
lazim dijumpai pada tanaman tembakau transgenik hasil transformasi genetik
dengan perantara A. tumefaciens. Beberapa penelitian menyebutkan rasio segregasi
tanaman tembakau transgenik generasi awal sesuai dengan rasio segregasi untuk
satu gen bebas yaitu 3:1 (Anggraito 2012, Halomoan 2012, Senjaya 2013, Waluyo
2013). Terjadinya penyimpangan segregasi transgen pada tanaman hasil
transformasi melalui A. tumefaciens kemungkinan dapat terjadi dengan prosentase
antara 10-50% (Yin et al. 2003). Hal tersebut dapat terjadi karena adanya integrasi
transgen pada daerah dengan sekuen berulang yang mengakibatkan terjadinya
inaktivasi transgen di dalam genom tanaman (Ye and Signer 1996). Hal inilah yang
menjadi penyebab tanaman tidak resisten terhadap higromisin walaupun di dalam
genom tanaman transgenik tersebut terdapat gen hpt. Karena gen hpt dipautkan
dengan gen PerL, maka pola pewarisan gen perL juga sama dengan pewarisan gen
hpt.
Tanaman transgenik yang memiliki fenotip hijau dan tahan pada media
seleksi higromisin selama 2 bulan selanjutnya dipindahkan pada media MS yang
tidak mengandung higromisin (Gambar 5) agar memiliki pertumbuhan yang lebih
baik. Tanaman transgenik pada media yang tidak mengandung higromisin
menunjukkan respon pertumbuhan yang cepat (Gambar 5a) dan pertumbuhan
lambat (Gambar 5b). Kelima tanaman T1 lainnya juga menunjukkan respon
7
pertumbuhan yang berbeda yaitu adanya pertumbuhan yang cepat dan lambat
(Lampiran 4).
Tabel 1 Nilai Khi-kuadrat pada uji 1 dan 2 gen bebas pada biji T1 N. tabacum
Rasio Uji
3:1
9:7
13:3
15:1
Nt-PerL-1
Nt-PerL-2
Nt-PerL-3
Nt-PerL-4
Nt-PerL-5
Nt-PerL-6
Nt-PerL-1
Nt-PerL-2
Nt-PerL-3
Nt-PerL-4
Nt-PerL-5
Nt-PerL-6
Nt-PerL-1
Nt-PerL-2
Nt-PerL-3
Nt-PerL-4
Nt-PerL-5
Nt-PerL-6
Nt-PerL-1
Nt-PerL-2
Nt-PerL-3
Nt-PerL-4
Nt-PerL-5
Nt-PerL-6
Jumlah Biji
Berkecambah
Tumbuh
Mati
31
438
59
614
8
615
24
653
5
463
19
388
31
438
59
614
8
615
24
653
5
463
19
388
31
438
59
614
8
615
24
653
5
463
19
388
31
438
59
614
8
615
24
653
5
463
19
388
Jumlah Biji
Galur
Total
486
739
661
727
534
474
486
739
661
727
534
474
486
739
661
727
534
474
486
739
661
727
534
474
TKc
17
66
38
50
66
67
17
66
38
50
66
67
17
66
38
50
66
67
17
66
38
50
66
67
Kc
469
673
623
677
468
407
469
673
623
677
468
407
469
673
623
677
468
407
469
673
623
677
468
407
𝑥 2 Hitung
1129.60
1439.85
1703.93
1720.19
1203.82
931.43
453.78
567.42
723.06
715.05
515.66
387.30
1655.72
2119.56
2466.86
2502.15
1739.07
1354.82
5865.96
7560.32
8570.32
8758.36
6021.09
4742.47
𝑥 2 tabel (db); α=𝑥 2 (1);5%=3.841; TKc: Tidak berkecambah; Kc: Berkecambah
a)
b)
Gambar 5 Pertumbuhan tanaman transgenik (Nt-PerL-2) yang resisten terhadap
higromisin di media MS tanpa antibiotik selama dua minggu:
a) pertumbuhan cepat; b) pertumbuhan lambat
Pertumbuhan tanaman yang terlihat lebih baik dengan berkembangnya daun
pada media tanpa higromisin masih perlu dibuktikan lebih lanjut. Hal tersebut
8
disebabkan oleh masih adanya kemungkinan pertumbuhan tanaman bukan
disebabkan oleh sifat resistensinya terhadap higromisin melainkan karena tanaman
tidak lagi berada pada media seleksi. Pemindahan tanaman dari media seleksi ke
media tanpa agen seleksi menyebabkan tanaman mampu beregenerasi kembali dan
mengalami pertumbuhan yang normal.
SIMPULAN
Gen PerL di bawah kendali promoter 35S CaMV terintegrasi di dalam
genom kelima tanaman Nicotiana tabacum SR1 transgenik generasi pertama. Gen
hpt yang dipautkan dengan gen PerL diwariskan ke generasi berikutnya. Jumlah
gen hpt yang terintegrasi ke dalam genom tanaman transgenik lebih dari dua kopi
gen.
SARAN
Analisis integrasi transgen pada tanaman transgenik generasi kedua (T1)
yang resisten terhadap higromisin perlu dilakukan. Selain itu, analisis segregasi
pada generasi T2 perlu dilakukan untuk mendapatkan tanaman transgenik
homozigot untuk memudahkan dalam melakukan uji tantang terhadap cekaman
abiotik. Untuk mememastikan jumlah kopi integrasi transgen di dalam genom
tanaman perlu dilakukan melalui teknik Southern Blot.
DAFTAR PUSTAKA
Amirullah A. 2008. Pengklonan dan karakterisasi gen PerL dari kedelai peka
cekaman alumunium [skripsi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.
Anggraito UY. 2012. Transformasi genetik Nicotiana benthamiana dan kedelai
dengan gen MaMt2 penyandi metallotionin tipe II dari Melastoma
malabathricum L. [disertasi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor.
Badawi GH, Yamauchi Y, Shimada E, Sasaki R, Kawano N, Tanaka K, Tanaka K.
2004. Enhanced tolerance to salt stress and water deficit by overexpressing
superoxide dismutase in tobacco (Nicotiana tabacum) chloroplasts. J Plant
Sci. 166: 919-928.
Brasileiro ACM, Aragou FJL. 2001. Marker genes for in vitro selection of
transgenic plants. J Plant Biotech. 3:113-121.
Budar F, Thia-Toong L, Van Montagu M, Hernalsteens JP. 1986. Agrobacteriummediated gene transfer results mainly in transgenic plants transmitting TDNA as a single Mendelian factor. Genetics. 114: 303-313.
9
Cobb JN. 2008. Studies on transformation of tomato (Solanum lycopersicum L.)
and Arabidopsis thaliana using chimerical construct of varying Tospovoral
origin [disertasi]. Bringham (USA): Bringham Young University.
Deroles SC, Gardner RC. 1988. Expression and inheritance of kanamycin resistance
in a large number of transgenic petunias generated by Agrobacteriummediated transformation. Plant Mol Biol. 11:355-364.
Doyle JJ, Doyle JL. 1987. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of
fresh leaf tissue. Phytochem Bull. 19:11-15.
Ganapathi TR, Suprasanna P, Rao PS, Bapat VA. 2004. Tobacco (Nicotiana
tabacum L.): a model system for tissue culture intervensions and genetic
engineering. Indian J Biotechnol. 3:171-184.
Gelvin SB. 2003. Agrobacterium-mediated plant transformation: the biology
behind the “gene-jockeying” tool. Microb and Molecul Biol. 67:16-37.
Gonzales A, Jimenez A, Vazquez D, Davies JE, Schindler D. 1978. Studies on the
mode of action of hygromycin B, an inhibitor of translocation in eukaryotes.
Biochem Biophys Acta. 521:459-469.
Gould J, Devey M, Hasegawa O, Ulian EC, Peterson G, Smith RH. 1990.
Transformation of Zea Mays L. using Agrobacterium tumefaciens and shoot
apex. Plant Physiol. 95: 426-434.
Halomoan N. 2012. Analisis segregasi gen hpt (hygromisin phosphotransferase)
pada tanaman tembakau transgenik generasi T0 [skripsi]. Bogor (ID): IPB.
Horsch RB, Fraley RT, Rogers SG, Sanders PR, Llyod A, Hoffmann N. 1984.
Inheritance of functional foreign genes in plants. Science J. 223:496-498.
Kashani K, Javaran MJ, Mohebodini M, Moieni A, Abadi MSD. 2012.
Regeneration and Agrobacterium-mediated transformation of three potato
cultivars (Solanum tuberosum cv. Desiree, Agria, and Marfona) by human
insulin gene. Austr J Crop Sci. 6:1212-1220.
Kohli A, Miro B, Twyman RM. 2010. Transgene integration, expression, and
stability in plants: strategies for improvement. Transgenic Crop Plants. 201237.
Lin J, Redies C. 2012. Histological evidence: housekeeping genes beta actin and
GADPH are of limited value for normalization of gene expression. Dev Genes
Evol. 222: 369-376.
Maneewan K, Bunnag S, Theerakulpisut P, Kosittrakun M, Suwanagul A. 2005.
Transformation of rice (Oryza sativa L.) cv. Chainat 1 using chitinase gene.
J Sci Technol. 27:1151-1162.
Senjaya SK. 2013. Pewarisan genetik transgen Hd3a pada tanaman Nicotiana
benthamiana transgenik [skripsi]. Bogor (ID): IPB.
10
Thellin O, Zorzi W, Lakaye B, De Borman B, Coumans B, Hennen G, Grisar T,
Igout A, Heinen E. 1999. Housekeeping genes as internal standards: use and
limits. J of Biotech. 75: 291-295.
Vicuna D, Malone RP, Dix PJ. 2011. Increased tolerance to abiotic stresses in
tobacco plants expressing a barley cell wall peroxidase. J Plant Sci. 6: 1-13.
Waluyo S, Sustiprijatno, Suharsono. 2013. Transformasi genetik tembakau dengan
gen cold shock protein melalui perantara Agrobacterium tumefaciens. J
AgroBiogen. 9:58-65.
Wulandari D, Widyastuti U, Tjahjoleksono A. 2014. Rekayasa genetik Nicotiana
tabacum SR1 dengan gen Peroksidase (PerL) [tesis]. Bogor (ID): Sekolah
Pascasarjana IPB.
Ye F, Signer ER. 1996. RIGS (repeat-induced gene silencing) in Arabidopsis is
transcriptional and alters chromatin configuration. Proc Natl Acad Sci.
93:10881-10886.
Yin Z, Plader W, Malepszy S. 2004. Transgene inheritance in plants. J Appl Genet.
45: 127-144.
11
LAMPIRAN
Lampiran 1 Komposisi Media MS (Murashige and Skoog) 1x
Kategori
Hara Makro
Hara Mikro
Vitamin
Bahan
NH4NO3
KNO3
KH2PO4
CaCl2.2H2O
MgSO4.7H2O
Na2EDTA
FeSO4.7H2O
H3BO3
Na2MoO4.2H2O
CoCl2.6H2O
KI
MnSO4.4H2O
ZnSO4.7H2O
CuSO4.5H2O
Thiamine-HCl
Niacine (asam nikotinat)
Pyridoxine-HCl
Glycine
Myo-Inositol
Sukrosa
Agar
pH
Konsentrasi dalam media (mg/l)
1650
1900
170
440
370
37.3
27.8
6.2
0.25
0.025
0.83
22.3
8.6
0.025
0.1
0.5
0.5
2.0
100
30g/l
7 g/l
5.8
Lampiran 2 Komposisi larutan penyangga TAE 50x dan 1x

Komposisi larutan penyangga TAE 50x
Bahan
Tris-HCl pH 8.3
Asam asetat pekat
EDTA

Konsentrasi (g/l)
2M
0.99 M
50 mM
Komposisi larutan penyangga TAE 1x dari stok TAE 50x
Bahan
Volume
TAE 50x
20 ml
Akuades
980 ml
12
Lampiran 3 Pertumbuhan biji transgenik tanaman Nt-PerL-1, Nt-PerL-2, Nt-PerL3, Nt-PerL-4, Nt-PerL-5, Nt-PerL-6 (berurutan dari kiri ke kanan)
selama 2 bulan di media MS mengandung higromisin (30mg/l)
Lampiran 4 Pertumbuhan enam galur tanaman transgenik a) Nt-PerL-1, b) NtPerL-2, c) Nt-PerL-3, d) Nt-PerL-4, e) Nt-PerL-5, f) Nt-PerL-6
resisten higromisin di media MS tanpa higromisin selama dua minggu
13
Lampiran 5 Perhitungan uji Khi-kuadrat (χ2) untuk rasio 3:1
Galur
Nt-PerL-1
Nt-Per-L2
Nt-PerL-3
Nt-PerL-4
Nt-PerL-5
Karakter
TKc
Tahan
Tidak
tahan
Total
TKc
Tahan
Tidak
tahan
Total
TKc
Tahan
Tidak
tahan
Total
TKc
Tahan
Tidak
tahan
Total
TKc
Tahan
Tidak
tahan
Total
TKc
Tahan
Nt-PerL-6
Tidak
tahan
Total
TKc : Tidak berkecambah
Observasi
(O)
31
Hipotesis
(H)
3/4
438
1/4
486
1
66
59
3/4
614
1/4
739
1
38
8
3/4
615
1/4
661
1
50
24
3/4
653
1/4
727
1
66
5
3/4
463
1/4
534
1
67
19
3/4
388
1/4
474
1
17
Harapan
(e)
364.5
121.5
486
554.25
184.75
739
495.75
165.25
661
545.25
181.75
727
400.5
133.5
χ2
305.14
824.46
1129.6
0
442.53
997.32
1439.8
5
479.88
1224.0
5
1703.9
3
498.31
1221.8
8
1720.1
9
390.56
534
355.5
813.26
1203.8
2
318.52
118.5
474
612.91
931.43
14
Lampiran 6 Perhitungan uji Khi-kuadrat (χ2) untuk rasio 9:7
Galur
Nt-PerL-1
Karakter
TKc
Tahan
Tidak
tahan
Total
TKc
Nt-Per-L2
Tahan
Tidak
tahan
Total
TKc
Nt-PerL-3
Tahan
Tidak
tahan
Total
TKc
Nt-PerL-4
Tahan
Tidak
tahan
Total
TKc
Nt-PerL-5
Tahan
Tidak
tahan
Total
TKc
Nt-PerL-6
TKc
Tahan
Tidak
tahan
Total
: Tidak berkecambah
Observasi
(O)
17
Hipotesis
(H)
-
31
9/16
438
7/16
486
1
66
-
59
9/16
614
7/16
739
1
38
-
8
9/16
615
7/16
661
1
50
-
24
9/16
653
7/16
727
1
66
-
5
9/16
463
7/16
534
1
67
-
19
9/16
388
7/16
474
1
Harapan
(e)
394.875
91.125
600.438
138.563
537.063
123.938
590.688
136.313
433.875
100.125
385.125
88.875
χ2
214.8
9
238.8
9
453.7
8
306.0
6
261.3
5
567.4
2
355.9
8
367.0
8
723.0
6
362.3
5
352.7
1
715.0
5
290.4
6
225.2
0
515.6
6
229.9
8
157.3
3
387.3
0
15
Lampiran 7 Perhitungan uji Khi-kuadrat (χ2) untuk rasio 13:3
Galur
Nt-PerL-1
Nt-Per-L2
Nt-PerL-3
Nt-PerL-4
Nt-PerL-5
Nt-PerL-6
TKc
Karakter
TKc
Tahan
Tidak
tahan
Total
TKc
Tahan
Tidak
tahan
Total
TKc
Tahan
Tidak
tahan
Total
TKc
Tahan
Tidak
tahan
Total
TKc
Tahan
Tidak
tahan
Total
TKc
Tahan
Tidak
tahan
Total
: Tidak berkecambah
Observasi
(O)
31
Hipotesis
(H)
13/16
438
3/16
486
1
66
59
13/16
614
3/16
739
1
38
8
13/16
615
3/16
661
1
50
24
13/16
653
3/16
727
1
66
5
13/16
463
3/16
534
1
67
19
13/16
388
3/16
474
1
17
Harapan
(e)
394.875
91.125
600.438
138.563
537.063
123.938
590.688
136.313
433.875
100.125
385.125
88.875
χ2
335.31
1320.4
1
1655.7
2
488.23
1631.3
3
2119.5
6
521.18
1945.6
8
2466.8
6
543.66
1958.4
8
2502.1
5
423.93
1315.1
4
1739.0
7
348.06
1006.7
6
1354.8
2
16
Lampiran 8 Perhitungan uji Khi-kuadrat (χ2) untuk rasio 15:1
Galur
Nt-PerL-1
Nt-Per-L2
Nt-PerL-3
Nt-PerL-4
Nt-PerL-5
Nt-PerL-6
Karakter
TKc
Tahan
Tidak
tahan
Total
TKc
Tahan
Tidak
tahan
Total
TKc
Tahan
Tidak
tahan
Total
TKc
Tahan
Tidak
tahan
Total
TKc
Tahan
Tidak
tahan
Total
TKc
Tahan
Tidak
tahan
Total
TKc : Tidak berkecambah
Observasi
(O)
17
31
Hipotesis
(H)
15/16
438
1/16
486
1
66
59
15/16
614
1/16
739
1
38
8
15/16
615
1/16
661
1
50
24
15/16
653
1/16
727
1
66
5
15/16
463
1/16
534
1
67
19
15/16
388
1/16
474
1
Harapan
(e)
394.875
91.125
600.438
138.563
537.063
123.938
590.688
136.313
433.875
100.125
385.125
88.875
χ2
395.73
5470.2
3
5865.9
6
579.84
6980.4
8
7560.3
2
603.79
7966.5
3
8570.3
2
634.41
8123.9
5
8758.3
6
490.67
5530.4
2
6021.0
9
407.19
4335.2
8
4742.4
7
17
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Bogor pada tanggal 6 Oktober 1992, merupakan anak
ketiga dari empat bersaudara pasangan Bapak Zainal Abidin P.M. dan Ibu Lina
Farida. Penulis menyelesaikan pendidikan dasar di SD Negeri Polisi 5 Bogor pada
tahun 2005, menyelesaikan pendidikan menengah pertama di SMP Negeri 5 Bogor
pada tahun 2008, dan pendidikan menengah atas di SMA Negeri 7 Bogor pada
tahun 2011. Penulis melanjutkan pendidikan sarjana di Institut Pertanian Bogor
(IPB) jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam.
Selama mengikuti perkuliahan, penulis aktif dalam beberapa kegiatan
kampus. Penulis terlibat aktif dalam kegiatan organisasi himpunan profesi
HIMABIO (Himpunan Mahasiswa Biologi) tahun 2012 hingga 2014 serta aktif
terlibat dalam berbagai kepanitiaan yang diselenggarakan himpunan. Penulis juga
pernah menjadi asisten praktikum Biologi Dasar dan asisten praktikum Genetika
Molekuler pada tahun 2015. Penulis mengikuti kegiatan Studi Lapang di Taman
Wisata Alam Telaga Warna dengan judul “Keanekaragaman Ordo Lepidoptera di
Kawasan Wisata Alam Telaga Warna” dan Praktik Lapang di PT MBRIO
Biotekindo dengan judul “Pengujian Mutu Produk Gula Palma secara Mikrobiologi
di PT MBRIO Biotekindo (MBRIO Food Laboratory).”