PAPER REKAYASA GENETIKA TRANSFORMASI OLEH: EGI

PAPER REKAYASA GENETIKA
TRANSFORMASI
OLEH:
EGI NURYADIN
P2BA12005
TIA AGUSTRIANI MAESYAROH
P2BA12009
WAHYUNI SETYANINGSIH
P2BA12014
KHUSNUL
P2BA12020
MARSAHIP
P2BA12024
PROGRAM PASCASARJANA ILMU BIOLOGI
UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN
PURWOKERTO
2013
TRANSFORMASI
Teknologi transfer gen dibedakan menjadi dua, yaitu langsung dan tidak
langsung (Herman, 1996). Contoh transfer gen secara langsung adalah
penembakan eksplan gen dengan gene gun atau divortex dengan silicon carbide
(karbid silikon) dan perlakuan pada protoplas tanaman dengan elektroporasi atau
dengan polyethylene glycol (PEG). Sedangkan transfer gen secara tidak langsung
adalah melalui vector Agrobacterium.
1. Transfer gen secara langsung
A. Penembakan partikel (particle bombardment)
Teknik paling modern dalam transformasi tanaman adalah
penggunaan metode penembakan partikel atau gene gun. Metode transfer
gen ini dioperasikan secara fisik dengan menembakkan partikel DNAcoated langsung ke selatau jaringan tanaman (Klein et al., 1988). Dengan
cara demikian, partikel dan DNA yang ditambahkan menembus dinding
sel dan membran, kemudian DNA melarut dan tersebar dalam sel secara
independen. Telah didemonstrasikan bahwa teknik ini efektif untuk
mentransfer gen pada bermacam-macam eksplan.
Penggunaan penembakan partikel membuka
peluang
dan
kemungkinan lebih mudah dalam memproduksi tanaman transgenik dari
berbagai
spesies
yang
sebelumnya
sukar
ditransformasi
dengan
Agrobacterium, khususnya tanaman monokotil seperti padi, jagung, dan
turfgrass.
B. Karbid silicon
Metode transfer gen lain yang kurang umum digunakan dalam
transformasi tanaman tetapi telah dilaporkan berhasil mentransformasi
jagung dan turfgraas adalah penggunaan karbit silikon. Suspensi sel
tanaman yang akan ditransformasi dicampur dengan serat karbid silikon
dan DNA plasmid dari gen yang diinginkan dimasukkan ke dalam tabung
Eppendorf kemudian dilakukan pencampuran dan pemutaran dengan
vortex (Kaeppler et al., 1990). Serat silicon carbide berfungsi sebagai
jarum injeksi mikro (microinjection) untuk memudahkan transfer DNA ke
dalam sel tanaman.
C. Elektroporasi
Metode transfer DNA yang umum digunakan pada tanaman
monokotil adalah elektroporasi dari protoplas, perlakuan polyethylene
glycol (PEG) pada protoplas dan kombinasi antara dua perlakuan tersebut
(Joersbo dan Brunstedt, 1991). PEG memudahkan presipitasi DNA dan
membuat kontak lebih baik dengan protoplas, juga melindungi DNA
plasmid mengalami degradasi dari enzim nuclease (Mass dan Werr, 1989).
Sedangkan
elektroporasi
dengan
perlakuan
listrik
voltase
tinggi
menyebabkan permiabilitas tinggi untuk sementara pada membran sel
dengan membentuk pori-pori sehingga DNA mudah penetrasi ke dalam
protoplas. Integritas membran kembali membaik seperti semula dalam
beberapa detik sampai semenit setelah perlakuan listrik. Jagung dan padi
telah berhasil ditransformasi melalui elektroporasi dengan efisiensi antara
0,1-1%. Kelemahan penggunaan protoplas sebagai explant untuk
transformasi adalah sulitnya regenerasi dari protoplas, dan ekstra
komplikasi, serta variasi somaklonal akibat panjangnya periode kultur.
2. Transfer gen secara tidak langsung
Dari banyak teknik transfer gen yang berkembang, teknik melalui
media vektor Agrobacterium tumefaciens paling sering digunakan untuk
mentransformasi tanaman dikotil. A. tumefaciens mampu mentransfer gen ke
dalam genom tanaman melalui eksplan baik yang berupa potongan daun (leaf
discs) atau bagian lain dari jaringan tanaman yang mempunyai potensi
beregenerasi tinggi (Hinchee et al., 1988; Mullins et al., 1990). Gen yang
ditransfer terletak pada plasmid Ti (tumor inducing). Segmen spesifik DNA
plasmid Ti disebut DNA T (transfer DNA) yang berpindah dari bakteri ke inti
sel tanaman dan berintegrasi ke dalam genom tanaman. Karena A.
tumefaciens merupakan patogen tanaman maka Agrobacterium sebagai
vektor yang digunakan untuk transformasi tanaman adalah bakteri dari jenis
plasmid Ti yang dilucuti virulen-sinya (disarmed), sehingga sel tanaman yang
ditransformasi oleh Agrobacterium dan yang mampu beregenerasi akan
membentuk suatu tanaman sehat hasil rekayasa genetik. Tanaman tersebut
akan menurunkan DNA T yang disarmed dan gen asing (dari sifat yang
diinginkan) ke keturunannya. Teknik transformasi melalui media vector
Agrobacterium pada tanaman dikotil telah berhasil tetapi sebaliknya tidak
umum digunakan pada tanaman monokotil. Meskipun demikian, beberapa
peneliti melaporkan bahwa beberapa strain Agrobacterium berhasil
mentransformasi tanaman monokotil seperti jagung dan padi. Transformasi
menggunakan Agrobacterum lebih banyak digunakan daripada menggunakan
penembak biolistik karena penggunaan Agrobacterium menghasilkan
proporsi yang lebih besar transgen terekspresi dengan jumlah lokus yang
lebih rendah (Ishida et al., 1996; Zhao et al., 1998).
Agrobacterium tumefaciens merupakan bakteri tanah gram positif
yang bersifat fitopatogen pada tanaman dikotil. Bakteri ini secara alami
mempunyai kemampuan untuk mentransfer potongan DNA atau disebut TDNA (transfer DNA) ke dalam genom tanaman dan menyebabkan
terbentuknya tumor (crown gall). Tumor ini merupakan sumber makanan atau
sebagai sumber karbon bagi Agrobacterium (Rajesh et al. 2008).
Terdapat tiga komponen genetik penting terlibat dalam proses
pembentukan tumor (Tzfira et al. 2004). Pertama, gen virulen kromosom
(chromosomal virulence), yang terdapat pada kromosom Agrobacterium dan
berfungsi dalam pelekatan bakteri dengan sel tanaman. Kedua, sekelompok
gen virulen (vir) yang terdapat dalam plasmid Ti (Tumor inducing),
berukuran 200 kb yang berperan dalam menginduksi transfer dan integrasi TDNA. Ketiga, daerah T-DNA yang juga terletak pada plasmid Ti (Daerah TDNA, dibatasi oleh LB (left border) dan RB (right border), mengandung gen
penting bagi Agrobacterium (Matthews et al. 2001, Zhou et al. 2003, Sha et
al. 2004). Daerah T-DNA mengandung gen iaaH, iaaM, dan ipt yang
menyandikan enzim-enzim penting dalam biosintesis auksin dan sitokinin,
yaitu zat penting untuk pembelahan sel sehingga terjadi pembelahan sel yang
tidak terkontrol dan menyebabkan terbentuknya tumor (Rajesh et al. 2008).
Efisiensi transformasi menggunakan Agrobacterum dipengaruhi oleh
strain Agrobacterium. Perbedaan antar-strain Agrobacteium ditentukan oleh
tipe kromosom dan tipe Ti-plasmid. Tipe kromosom dalam sel bakteri
Agrobacterum a.l. terdiri dari octopine, nopaline, dan chrysopine; sedangkan
tipe Ti-plasmid a.l. terdiri dari octopine, nopaline, chrysopine, dan
succcinamopine. Grant et al. (2003) melaporkan bahwa strain KYRT1 tiga
kali lebih efisien daripada AGL1 dalam transformasi kacang kapri.
METODE
 Bahan utama yang perlu disediakan yaitu bakteri Escherichia coli DH5α (E.
coli DH5α) mengandung gen cry1Ab pada plasmid Psbb A. tumefaciens
EHA105 pembawa p Cambia130.
 DNA plasmid diisolasi dari kedua bakteri tersebut dengan metode lisis alkali
(Sambrook et al., 1989 dalam Listanto et al, 2010).
 Kualitas dan kuantitasnya dicek dengan elektrofloresis pada gel agarose 0,8%
dan dianalisis dengan program QuantityOne™ (Biorad).
 Gen cry1Ab diisolasi dengan memotong plasmid pSBB dengan enzim restriksi
HindIII.
 Hasil potongan dipisahkan dengan agarose elektroforesis.
 DNA gen cry1Ab diisolasi dari gel agarose dengan metode Freeze ‘N Spin
(Biorad).
 Plasmid pCambia1301 dipotong dengan enzim restriksi HindIII serta
dihilangkan gugus fosfatnya dengan metode defosforilasi menggunakan
alkaline phos-phatase.
 Fragmen pCambia yang telah terdefosforilasi diligasi dengan gen cry1Ab
menggunakan enzim ligase.
 Hasil ligasi ditransformasi ke dalam E. coli dan A. tumefaciens.
 Transformasi ke dalam E. coli menggunakan metode kejutan panas (Sambrook
et al. 1989 dalam Listanto et al, 2010), sedangkan transformasi ke dalam A.
tumefaciens dilakukan dengan metode kejutan dingin (An et al. 1988 dalam
Listanto et al, 2010) atau tri-parental mating.
 Hasil transformasi ditumbuhkan pada media yang mengandung kanamisin 50
mg/l.
Gambar 1. Proses infeksi alami dari Agrobacterium tumefaciens.
Sel berwarna coklat adalah sel Agrobacterium dan warna hijau adalah sel
tanaman. Senyawa induser yang dikeluarkan tanaman saat luka akan
mengaktifkan gen vir A dan G untuk selanjutnya mengaktifkan gen-gen vir
lainnya sehingga proses transfer daerah T-DNA dari Agrobacterium ke dalam sel
tanaman terjadi. (sumber: http://www.rasmusfrandsen.dk/atmt. htm).
DAFTAR PUSTAKA
Grant, J.E., L.M.J. Thomson, M.D.Pither-Joyce, T.M. Dale, and P.A. Cooper.
2003. Influence of Agrobacterum tumefaciens strain on the production of
transgenic peas (Pisum sativum L.). Plant Cell Rep. 21:1207-1210.
Herman M 2010. Aplikasi teknik rekayasa genetik dalam perbaikan sumber daya
genetik tanaman untuk ketahanan cekaman biotik. Bul Plasma Nutfah Vol
16(1):172.
Hinchee, M.A.W., D.V. Connor-Ward, C.A. Newell, R.E. MC. Donell, S.J. Sato,
C.S. Gasser, D.A. Fischoff, D.B. Re, R.T. Fraley, and R.B. Horsch. 1988.
Production of transgenic soybean plants using Agrobacterium mediated
DNA transfer. Bio/Tech. 6:915-922.
Ishida, Y., H. Saito, S. Ohta, Y. Hiei, T. Komari, T. Kumashiro. 1996. High
efficiency transformation of maize (Zea Mays L.) mediated by
Agrobacterium tumefaciens. Nature Biotechnol 14: 745-750.
Joersbo, M. and J. Brunstedt. 1991. Electroporation mechanism and transient
expression, stable transformation and biological effects in protoplast.
Physiologia Plantarum 81:256-264.
Klein, T.M., M. Fromm, A. Weissinger, D. Tomes, S. Scahaa, M. Sletten, and J.
Sanford. 1988. Transformation of maize cells using hign velocity
microprojectile. Proc. Natl. Aca. Sci. USA. 85:4305-4309.
Listanto E, Habib R, Liberty, Tri J. Santoso, Saptowo J. Pardal, Ida H. Somantri,
Altosar, dan M. Herman. 2010. Konstruksi dan Kloning Plasmid
pCambia1301 dengan Gen Cry1Ab. Prosiding
Mass, C. and W. Werr. 1989. Mechanism and optimized conditions for PEG
mediated DNA transfection into plant protoplast. Plant Cell Rept. 8:148151.
Matthews PR. Ming-Bo W, Waterhouse PM, Thornton S, Fieg SJ, Gubler F,
Jacobsen JV. 2001. Marker gene elimination from transgenic barley, using
co-transformation with adjacent "twin T-DNAs" on a standard
Agrobacterium transformation vector. Mol Breed 7:195-202
Mullins, M.G, F.C. Tang, and O. Facciotti. 1990. Agrobacterium mediated genetic
transformation of grape vines: transgenic plants of Vitis rupestris Schwwlw
and buds of Vitis vinefera L. Bio/Tech. 8:1041- 1045.
Rajesh S, Krishnaveni S, Sudhakar D, Raveendran M, Sivakumar P, Gnanam R,
Manickam A. 2008. Agrobacterium-mediated transformation on indica rice
(Oryza sativa L.), IR64 with mungbean LEA protein gene for water-stress
tolerance. Am J Plant Physiol 3(3):101-110
Sha Y, Li S, Pei Z, Luo L, Tian Y, He C. 2004. Generation and flanking sequence
analysis of a rice T-DNA tagged population. Theor Appl Genet 108:306-314
Tzfira T, Li JX, Lacroix B, Citovsky V. 2004. Agrobacterium T-DNA integration:
molecules and models. Trends Genet 20:375-383.
Zhao, Z.Y., W. Gu, T. Cai, L.A. Tagliani, D.A. Hondred, D. Bond, S. Krell, M.L.
Rudert, W.B. Bruce, D.A. Pierce. 1998. Molecular analysis of T0 plants
transformed by Agrobacterium and comparison of Agrobacterium-mediated
transformation with bombardment transformation in maize. Maize Genet.
Coop. Newslett. 72: 34-37.
Zhou HY, et al. 2003. Generating marker-free transgenic tobacco by
Agrobacterium-mediated transformation with double T-DNA binary vector.
Acta Bot Sin 45:1103-1108