Laporan Praktikum 5

Laporan Praktikum 5
Inti dan Mitokondria
Nama
: Cokhy Indira Fasha
NIM
: 10699044
Kelompok
:4
Tanggal Praktikum : 10 September 2001
Tanggal Laporan
: 17 September 2001
Asisten
: Rizki Ali Akbar
Laboratorium Biologi Sel dan Molekuler
Departemen Biologi
Institut Teknologi Bandung
2001
Laporan Praktikum 5
Inti dan Mitokondria
A. Tujuan
Tujuan dari percobaan mengenai inti dan mitokondria adalah :
1. mengisolasi inti dan mitokondria
2. mempelajari karakteristik protein yang terkandung dalam setiap fraksi sentrifugasi sel
B. Cara Kerja dan Hasil Pengamatan
C. Pembahasan
Percobaan ini secara garis besar memisahlan inti dan mitokondria dari bagian sel yang lain
sehingga inti dan mitokondria ini dapat digunakan unutk keperluan lain. Selain itu percobaan ini juga
mempelajai karakteristik protein semua supernatan dan pelet dengan mengelektrolisiskannya pada
SDS-PAGE.
Inti sel merupakan bagian dalam sel yang mengandung gen paling banyak yang mengontrol sel
(gen selebihnya terletak di mitokondria dan kloroplas). Pada sel eukariot, inti sel dan sitoplasma
dipisahkan oleh membran inti sel yang berlapis dua. Membran ini meregulasi pemasukan dan
pengeluaran makromolekul dan partikel tertentu. Dalam inti sel, DNA bersama dengan protein
bergabung membentuk kromatin. Pada saat pembelahan sel, kromatin ini menebal dengan dengan cara
membentuk struktur koil berganda menjadi kromosom. Setiap eukariot memiliki jumlah kromosom
yang spesifik. Mekanisme pengontrolan sel oleh inti sel ialah dengan cara sintesis protein melalui
pengiriman mRNA, cetakan protein, ke ribosom. Dalam ribosom ini sel asam-asam amino yang
dibawa oleh tRNA ditranslasikan dengan mRNA sebagai cetakannya.
Mitokondria ditemui hampir pada semua sel eukariot. Pada beberapa jenis sel, hanya ada satu
mitokondrion (tunggal) tetapi biasanya sebuah sel memiliki ratusan atau bahkan ribuan mitokondria.
Jumlah mitokondria ini dipengaruhi oleh tingkat aktivitas metabolisme sel tersebut. Ukuran panjang
mitokondria adalah antara 1 sampai 10 m. Mitokondria dibungkus oleh selubung dari dua membran
yang memiliki protein membran yang khas, Membran luar bertekstur halus, sedangkan membran
dalamnya kasar dengan lipatan yang dinamakan cristae. Membran-membran ini membagi
mitokondrion menjadi dua ruangan yang berbeda. Yang pertama adalah ruangan intermembran,
selanjutnya matriks mitokondria yang dibungkus oleh membran dalam. Beberapa langkah
metabolisme terjadi di matriks karena konsentrasi enzim di lokasi tersebut tinggi. Protein lain dalam
respirasi, termasuk enzim pembentuk ATP berada dalam membran dalam. Cristae menyebabkan
membran dalam mitokondria memiliki permukaan yang luas yang meningkatkan prodiktivitas
respirasi selular.
Mitokondria menunjukkan banyak kesamaan dengan organisme prokariot yang hidup bebas; antara
lain, memiliki ukuran dan bentuk yang sering kali sama, sama-sama mengandung DNA, sama-sama
memproduksi protein, sama-sama memperbanyak diri dengan cara membelah menjadi dua. Bila
sebuah sel eukariot dipecah-pecah, maka dapat dibuktikan bahwa mitokondria bertanggung jawab
untuk respirasi dan proses ini tidak terjadi bada bagian lain dalam sel yang sama. Tanpa mitokondria,
sel hewan dan sel jamur harus menjadi organisme anaerobik, yang harus menggunakan proses
glikolisis yang kurang efisien untuk memperoleh energinya. Ada pendapat yang menyatakan bahwa
sel eukariot adalah turunan dari organisme anaerobik primitif yang berhasil betahan hidup, ketika
oksigen di bumi semakin banyak, dengan cara mencaplok bakteri aerobik. Bakteri aerobik ini dipaksa
untuk bersimbiosis dengan tujuan memanfaatkan kemampuannya memakai oksigen di atmosfer untuk
menhasilkan energi. Pada kenyataannya memang banyak sel eukariot lain yang bersimbiosis dengan
sel prokariot dengan cara mencaplok sel prokariot tersebut, seperti contohnya pada amoeba Pelomxya
palustris yang meskipun tidak memilik mitokondria, tetapi dapat melangsungkan metabolisme aerobik
dengan memelihara bakteri aerobik dalam sitoplasmanya dalam suatu hubungan simbiotik yang
permanen.
Untuk mempelajari suatu fungsi organel tertentu diperlukan fraksinasi sel guna memisahkan
organel-organel. Metode yang biasa digunakan dalam fraksinasi sel adalah sentrifugasi diferensial.
Prinsip kerjanya ialah pemisahan molekul berdasarkan massanya. Molekul bermasssa besar terletak di
bawah sedangkan molekul bermassa kecil terletak di bagian atas.
Fraksinasi ini dimulai dari homogenisasi. Tujuannya adalah untuk memecahkan sel tanpa merusak
organel. Selanjutnya memutar homogenat tersebut sehingga didapatkan pellet, bagian yang terdiri dari
struktur yang lebih besar yang mengendap, dan supernatan, bagian yang terdiri dari struktur yang lebih
kecil yang tersuspensi dalam cairan diatas pellet. Supernatan didekantasi ke tabung lain dan
disentrifuga lagi. Proses ini diulangi, dan kecepatan putaran ditingkatkan sehingga komponen yang
lebih kecil terkumpul dalam masing-masing pellet setelah sentrifugasi.
Pada percobaan ini digunakan sel hati dengan alasan bahwa sel hati memiliki mitokondria yang
relatif banyak karena sel hati ini aktif dalam melaksanaan metabolismenya. Sel-sel lain yang dapat
dipergunakan untuk pengisolasian mitokondria antara lain sel otot dan sel sperma. Pada prosesnya sel
ini dimurnikan terlebih dahulu dengan melakukan perfusi organ hati tikus. Perfusi bertujuan untuk
mengeluarkan sel-sel darah dari hati. Teknik pelaksanaannya ialah dengan menyuntikkan larutan NaCl
isotonis (salin) ke vena porta hepatica sehingga sel darah yang berada dalam kapiler darah yang berada
dalam hati terdorong keluar. Sebagai hasilnya organ ini terlihat pucat.
Setelah didapatkan organ hati yang mengandung sel hati yang cukup murni, selanjutnya dilakukan
homogenisasi. Homegenisasi ini dilakukan dengan cara menggerus organ hati ini setelah ditambahkan
medium homogenisasi. Dalam medium ini terkandung sukrosa yang fungsinya menjaga agar sel tetap
hidup. Selain itu terdapat EDTA yang berperan sebagai pengikat Mg2+ yang berkaitan dengan
maserasi (pemisahan) sel, etanol sebagai pengendap DNA dan MOPS sebagai pendukung fungsi
sukrosa. Medium homogenasi ini sebelum ditambahkan ke hati ditambahkan dengan PMSF, asam caminocaproat dan DTT yang berfungsi sebagai protease (pemecah protein). Selanjutnya dilakukan
homegenisasi yang dilakukan pada kecepatan 1000 rpm selama 10 menit pada suhu 4OC. Tujuan
dilakukannya hal ini adalah untuk melanjutkan proses homogenisasi yang dilakukan sebelumnya
sehingga dalam campuran itu seluruh komponen yang digunakan (inti dan mitokondria) benar-benar
tercampur secara homogen. Pada proses ini didapatkan sel darah yang juga dipisahkan dari
homogenat.
Lalu dilakukan fraksinasi subseluler yang memisahkan inti dari campuran dengan sentifugasi pellet
yang didapatkan dari sentrifugasi pertama dan MH yang dilakukan pada kecepatan 70 G selama 10
menit pada suhu 4OC untuk membuang debris berupa hepatosit yang hancur, darah dan inti.
Selanjutnya dilakukan dekantasi dan sekali lagi dilakukan sentrifugasi ketiga 70 G, 10 menit dengan
campurannya adalah pellet pada sentrifugasi yang kedua dengan MH. Pellet yang didapatkan dari
sentrifugasi 2 dan 3 mempunyai komponen sebagian besar inti. Selanjutnya kedua supernatan dari
sentrifugasi 2 dan 3 dicampurkan dan cairan ini dinamakan supernatan postnuclear. Cairan ini sudah
bebas dari inti sel dan siap digunakan untuk pemisahan selanjutnya. Percobaan yang dilakukan hanya
sampai disini saja karena keterbatasan waktu.
Bila percobaan ini dilanjutkan, setelah itu dilakukan pemisahan mitokondria dari campuran dengan
cara sentrifugasi pada 1950G, 10 menit, 4OC. Sama seperti pemisahan inti dari campuran, proses
pemisahan mitokondria ini dilakukan sebanyak dua kali dan kedua pellet yang dihasilkan mengandung
mitokondria sedangkan kedua supernatan digabungkan dan dinamakan supernatan post-mitokondria
yang bebas dari organel mitokondria.
Dari percobaan ini didapatkan tiga bagian, yaitu pellet yang mayoritas mengandung inti, pellet
yang mayoritas mengandung mitokondria serta supernatan post-mitokondria. Selanjutnya dilakukan
elektroforesis pada SDS-PAGE seluruh bagian yang dihasilkan dan akan didapatkan hasil yang
berbeda. Hal ini disebabkan kandungan protein antara ketiga bagian tersebut berbeda sesuai dengan
fungsinya masing-masing.
D. Kesimpulan
1. Pengisolasian organel-organel sel dapat dilakukan dengan menggunakan teknik sentrifugasi
diferensial yang memisahkan bagian berdasarkan massanya.
2. Pemisahan organel inti dilakukan dengan sentrifugasi pada 70 G selama 10 menit pada suhu
4OC.
3. Pemisahan organel mitokondria dilakukan dengan sentrifugasi pada 1950 G selama 10 menit
pada suhu 4OC.
4. Setiap jenis organel memiliki protein yang khas sesuai dengan fungsinya masing-masing.
5. Pendeteksian keberadaan protein dapat dilakukan dengan elektroforesis pada SDS-PAGE.
E. Daftar Pustaka
1. Albert, B. et al. Biologi Molekuler Sel, 2nd ed. Jakarta : Gramedia, 1994.
2. Campbell, Neil A. Biology 4th ed. Singapore : Addison Wesley Longman, 1996.
3. Choinski, John S. Experimental Cell and Molecular Biology. Arkansas : Wm. C. Brown
Publishers, 1992.