7 bahan dan metode

7
BAHAN DAN METODE
Alat dan Bahan
Bahan yang dipakai ialah biakan khamir
(Saccharomyces cerevisiae), yeast extract,
glukosa, baktoagar, baktopepton, etanol,
pewarna Coomassie Blue 0,01N, ekstrak daun
Jambu Biji (Psidium guajava L.), ekstrak
daun Jati Belanda (Guazuma ulmifolia
Lamk.), dan ekstrak daun Salam (Eugenia
polyantha Wight.).
Alat
yang
digunakan
ialah
spektrofotometer, Sentrifus Beckman J 21,
mikroskop Olympus CX40, kertas aluminium,
laminar air flow cabinet, lemari es, cawan
petri, neraca analitik, mikropipet, tabung
eppendorf, jarum ose, kaca sebar, autoklaf,
kapas, vortex dan seperangkat alat gelas
lainnya.
Metode Penelitian
Pembuatan Media (Campbell 1991)
Media padat YEPD 100 ml dibuat dari 1
g yeast extract, 2 g baktopepton, 2 g glukosa,
1.8 g baktoagar dan akuades hingga 100 ml,
lalu disterilkan dengan autoklaf pada suhu
1200C selama 15 menit. Adapun media padat
Petit dibuat dari 100 ml dibuat dari 1 g yeast
extract 1%, 2 g baktopepton 2%, 0.1 g
glukosa 1%, 2 ml etanol 2%, 1.8 g bakto agar
1.8%, dan akuades hingga 100 ml. Setelah
itu disterilkan dengan autoklaf pada suhu
120oC selama 15 menit dengan tekanan
sekitar 10 atm. Komposisi media cair YEPD
sama dengan pembuatan media padat YEPD
hanya saja tanpa baktoagar, begitu pula
pembuatan
media
cair
Petit
tanpa
penambahan baktoagar.
Peremajaan Sel (Campbell 1991)
Sel-sel khamir diremajakan pada media
YEPD padat dengan menggoreskan I ose
khamir pada media padat YEPD dan
diinkubasi pada suhu 270C selama 2 hari.
Hasil peremajaan akan digunakan sebagai
biakan perlakuan.
Inkubasi dan Pemanenan (Campbell 1991)
Sel-sel khamir ditumbuhkan pada 100 ml
media YEPD cair dan media petit cair dengan
perbandingan udara: kultur 5:1. Setiap 24 jam
diukur kerapatan optikal (Optical Density; OD)
pada λ 240 nm hingga jumlah sel mencapai
5x108 sel /ml pada shaker dengan suhu 270C.
Sel dipanen dengan cara dipusing pada
kecepatan 4000 G yang setara dengan 4000
rpm selama 10 menit dan peletnya dicuci dua
kali dengan 40 ml akuades. Sebagai persiapan
untuk perlakuan, 200 µl kultur sel khamir
dipindahkan ke beberapa tabung eppendorf.
Perlakuan Dengan Ekstrak (Granot 2003)
Perlakuan dilakukan dengan menambahkan
50 ppm, 100 ppm, 500 ppm, 1000 ppm, dan
2000 ppm masing-masing ekstrak daun jambu
biji, ekstrak daun salam dan ekstrak daun Jati
Belanda ke dalam tabung eppendorf yang berisi
200 µl sel-sel kamir. Sebanyak 200 µl sel-sel
kamir dipindahkan ke dalam tabung eppendorf
yang masing-masing berisi 400 µl glukosa 10%
sebagai kontrol glukosa (sehingga pada volume
akhir menjadi 4%), 400 µl akuades sebagai
kontrol akuades, 400 µl media cair YEPD
sebagai kontrol media. Ekstrak dicampur secara
homogen kemudian diinkubasi pada 270C
selama tiga hari.
Uji Viabilitas (Granot 2003)
Untuk melakukan uji viabilitas setiap 24
jam dilakukan pengambilan sebanyak 50 µl
sel dari biakan perlakuan yang telah
diencerkan sebesar 108 kali. Sel-sel khamir
tersebut disebar merata ke cawan petri yang
berisi media YEPD padat dan diinkubasi
selama tiga hari pada suhu 280C.
Uji Petit (Granot 2003)
Untuk melakukan uji viabilitas, setiap 24
jam dilakukan pengambilan sebanyak 50 µl
sel dari biakan perlakuan yang telah
diencerkan sebesar 108 kali. Sel-sel khamir
tersebut disebar merata ke cawan petri yang
berisi media petit padat dan diinkubasi selama
tiga hari pada suhu 270C.
Frekuensi Petit (Granot 2003)
Sel-sel khamir yang berubah menjadi
koloni petit tampak berukuran lebih kecil
dibanding sel-sel khamir normal. Sel-sel
khamir yang berubah menjadi koloni petit
dihitung frekuensi petitnya dengan rumus :
Pengamatan Mikroskopik
Preparat dibuat dari sel-sel khamir normal
dan petit tanpa dan dengan perlakuan yang
difiksasi dan diberi pewarna Coomassie blue
0,01N. Pengamatan dilakukan dibawah
mikroskop Olympus CX40 yang memiliki
fasilitas kamera foto dengan perbesaran
hingga 1500x.