Nama : Restu Aulia Arham NIM : 1810411001 Tugas Bioteknologi Resume COVID-19 COVID-19 adalah penyakit yang disebabkan oleh Severe Acute Respiratory Syndrome Corona Virus 2 (SARS-CoV-2). Ketika seseorang terinfeksi virus ini maka beberapa gejala yang umum adalah : 1. Demam 2. Batuk 3. Nafas yang pendek Untuk memulai test, sampel diperoleh dengan swab nasofaring dan orofaring. Untuk swab nasofaring, sampel diambil melalui hidung dengan memasukkan swab kedalam hidung hingga mencapai nasofaring kemudian diusap secara lembut dan berputar pada bagian nasofaring sehingga diperoleh sampel yang merata pada alat swab. Kemudian alat tersebut segera dimasukkan ke tabung steril yang berisi Viral Transport Medium. Metode standar untuk corona virus ini adalah Polymerase Chain Reaction (PCR) yang merupakan metode yang secara luas digunakan dalam biologi molekuler untuk melipatgandakan spesifik fragmen DNA dengan cepat. Corona Virus mengandung genom RNA strain tunggal yang sangat panjang. Untuk mendeteksi virus ini dengan PCR, molekul RNA harus diubah menjadi DNA Komplementer berurutan dengan Reverse Transcriptase. Kemudian sintesis DNA yang baru diamplifikasi dengan PCR standar yakni RT-PCR (Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction). Langkah-langkah metode RT-PCR : 1. Ekstraksi RNA beberapa alat yang digunakan untuk pemurnian RNA tersedia untuk isolasi yang nyaman, cepat dan efektif. Untuk mengekstrak dengan alat tersebut dilakukan dengan cara : a. Sampel ditambahkan didalam tabung mikrosentrifus kemudian dicampur dengan buffer lisis. Buffer ini sangat mendenaturasi dan biasanya terdiri dari fenol dan guanidin isotiosianat. Selain itu, terdapat Rnase untuk memastikan isolasi RNA virus utuh. b. Sampel dan buffer lisis di vortex lalu diinkubasi pada suhu kamar c. Setelah sampel di lisis dilanjutkan dengan menggunakan kolom spin. Sampel dimasukkan kedalam kolom spin kemudian dilakukan sentrifugasi. Prosedur ini merupakan metode ekstraksi fasa padat, dimana fasa diam terdiri dari matriks silika. Dibawah kondisi garam dan pH yang optimal, molekul RNA terikat ke membran silika gel dan pada saat yang sama protein dan kontaminan lainnya tidak disimpan. Nama : Restu Aulia Arham NIM : 1810411001 Tugas Bioteknologi d. Setelah itu, kolom spin ditempatkan ke dalam tabung pengumpul yang bersih dan filtratnya dibuang. Kemudian buffer pencuci ditambahkan. e. Kolom di sentrifugasi kembali, memaksa buffer pencuci melewati membran. Ini memghilangkan kotoran yang tersisa dari membran hanya menyisakan RNA yang terikat pada silika gel. f. Setelah dicuci, sampel ditempatkan dalam tabung mikrosentrifus yang bersih dan buffer elusi ditambahkan dan di sentrifugasi lagi. Buffer elusi menghilangkan RNA virus dari kolom spin. g. RNA murni yang bebas dari protein, inhibitor dan kontaminan lainnya diperoleh. 2. Pembuatan campuran reaksi untuk amplifikasi PCR a. Pada tahap ini dibuat master mix yang terdiri dari buffer, enzim Reverse Transcriptase, nukleotida, reverse primer, forward primer, probe TaqMan dan DNA Polimerase serta ditambahkan sampel RNA yang diperoleh sebelumnya. b. Tabung tersebut di vortex kemudian dimasukkan ke dalam pelat PCR yang umumnya berisi 96 sumur yang memungkinkan analisis beberapa sampel secara bersamaan. c. Selanjutnya, pelat diletakkan di mesin RT-PCR yang pada dasarnya merupakan penggerak termal yang digunakan untuk mendeteksi Covid-19 dengan amplifikasi sekuens target pada gen Rdrp, gen E dan gen N. Pilihan gen target tergantung pada primer dan urutan probe. Langkah-langkah dalam RT-PCR a. Transkripsi terbalik, dimana sintesis DNA komplementer untai pertama, dipersiapkan dengan reverse primer yang hibridisasi ke bagian komplementer dari genom RNA virus b. Reverse transcriptase kemudian menambahkan nukleotida DNA ke ujung 3-primer. Mensintesis DNA yang melengkapi RNA virus. Suhu dan durasi langkah ini tergantung pada primer, RNA target, dan Reverse Transcriptase yang digunakan c. Selanjutnya, langkah denaturasi awal diterapkan, menyebabkan denaturasi hibrida RNA-DNA. Langkah ini diperlukan untuk aktivasi DNA polimerase sekaligus inaktivasi Reverse Transcriptase. PCR terdiri dari serangkaian siklus termal dnegan setiap siklus terdiri dari langkah-langkah denaturasi, anil dan ekstensi. Siklus 1 - Denaturasi : pemanasan ruang reaksi hingga 95 derajat Celcius untuk mendenaturasi DNA untai ganda - Anil : suhu diturunkan hingga 58 derajat Celcius yang memungkinkan penganilan forward primer ke bagian komplementer darri DNA untai tunggal. Suhu anil bergantung pada panjang dan komposisi primer - Ekstensi : DNA polimerase mensintesis DNA baru untuk melengkapi untai templat DNA dengan menambahkan nukleotida bebas dari campuran reaksi yang melengkapi Nama : Restu Aulia Arham NIM : 1810411001 Tugas Bioteknologi template dengan arah 5’ ke 3’. Suhu yang digunakan pada langkah ini tergantung pada DNA polimerase yang digunakan. Diperoleh target DNA untai ganda. Siklus 2 - Denaturasi : dari DNA untai ganda siklus 1, menghasilkan 2 molekul DNA beruntai tunggal - Anil : Suhu reaksi diturunkan dan memungkinkan pelekatan primer ke masing-masing template DNA untai tunggal dan memasukkan probe TaqMan ke bagian komplementer DNA target. Probe TaqMan terdiri dari fluorofor yang melekat pada ujung 5’ probe oligonukleotida kemudian fluorisensi dipancarkan fluorofor sat tereksitasi oleh sumber cahaya. Juga, probe ini terdiri dari quencher di ujung 3’. - Ekstensi : DNA polimerase mensintesis untaian baru saat polimerase mencapai probe TaqMan aktivitas nuklease 5’endogennya membelah probe, memisahkan pewarna dari quencher. Siklus 3 - Denaturasi : dari setiap siklus PCR lebih banyak molekul yang dilepaskan - Anil : mengalami peningkatan intensitas fluoresensi sebanding dengan jumlah amplikon yang disintesis - Ekstensi : memungkinkan estimasi jumlah urutan tertentu yang ada dalam sampel Dari ketiga siklus diatas, jumlah potongan DNA beruntai ganda menjadi 2 kali lipat disetiap siklusnya. Oleh karena itu PCR dapat dugunakan untuk menganalisis sampel dalam jumlah yang sangat kecil. Deteksi oleh PCR : Untuk pengukuran sinar fluoresensi, bagian pada alat PCR seperti : a. Sebuah lampu Tungsten-Halogen b. Filter eksitasi c. Cermin d. Lensa e. Filter emisi dan f. Perangkat charge-coupled-kamera CCD Langkah-langkah a. Cahaya yang difilter dari lampu dipantulkan dari cermin, melewati lensa kondensasi, dan difokuskan ke tengah masing-masing sumur b. Kemudian cahaya fluorescent yang dipancarkan dari sumur memantulkan cermin melewati filter emisi dan dideteksi oleh kamera CCD c. Dalam setiap siklus PCR, cahaya fluorofor tereksitasi dapat dideteksi oleh CCD yang mengubah cahaya yang ditangkapnya menjadi data digital. Metode ini dikenal dengan Nama : Restu Aulia Arham NIM : 1810411001 Tugas Bioteknologi Real Time PCR yang memugkinkan pemantauan kemajuan reaksi PCR seperti yang terjadi secara langsung (waktu nyata).
