Document

(B. MIPA Sains)
Identifikasi Gen Halogenase dari Alteromonas Luteoviolaceus Penghasil Antibiotik
Pentabrompseudilin secara Hibridisasi
Mulyani, Sri; Astirin, Okid Parama
Fakultas KIP UNS, Penelitian, DP2M Dikti, Hibah Fundamental Lanjutan, 2012
Tujuan jangka panjang dari penelitian ini adalah membuktikan adanya kemiripan jalur biosintesis
teresterial antibiotic pentaklorpseudilin dari Actinoplanes sp. ATCC 33002 dan marine antibiotic
pentabrompseudilin dari Alteromonas luteoviolaceus. Pembuktian tersebut dilakukan secara analisis
genetic dengan terlebih dahulu dilakukan isolasi biosintetic gene cluster dari pentabrompseudilin
tersebut. Sementara ini petensial biosintetic gen cluster dari pentaklorpseudilin sudah diidentifikasi oleh
grup penelitian Prof. Dr. K.-H. van Pee di TU Dresden, akan tetapi belum dipublikasikan (Mann, 2005).
Pentaklorpseudilin dan pentabrompseudilin mempunyai struktur yang mirip dan hanya berbeda pada
atom-atom halogen yang diikatnya. Hasil pembuktian ini akan memberikan tambahan informasi dan
memperkaya khasanah ilmu pengetahun tentang metabolism antibiotic khususnya yang mengandung
senyawa halogen, dapat sebagai acuan mekanisme obat dalam eksplorasi obat baru untuk menghadapai
masalah resistensi yang akhir-akhir menjadi masalah dunia. Target khusus yang akan dicapai dalam
penelitian ini adalah mengidentifikasi adanya gen halogenase dalam DNA kromosom A. luteoviolaceus
pengahasil pentabrompseudilin secara hibridisasi dengan menggunakan probe DNA gen halA/B dari
Actinoplanes sp. ATCC. Selanjutnya gen halogenase yang teridentifikasi diisolasi dengan menggunakan
vector untuk sequencing (pBluescript SK dan pUC19).
Untuk mencapai tujuan di atas, maka penelitian akan dilakukan mengikuti pendekatan dan metode yang
lazim digunakan dalam penelitian molecular biologi. Penelitian ini dilakukan secara bertahap dalam tiga
tahun. Tahun pertama penelitian ini dilakukan isolasi total DNA A. luteoviolaceus dengan 2xKirby mix
(Hopwood et al, 1985) dan DNA plasmid pEThalB yang mengandung gen halA/B dari Actinoplanes sp.
ATCC dengan metode lisis alkali (Sambrook et al, 2001). Tahun kedua dilakukan suothern blotting DNA
kromosom yang sudah dipotong dengan enzim BamHI, Eco RI, HindIII, PstI,dan SacI ke dalam membran
nitroselulosa dan dihibridisasi dengan probe DNA (halB) yang dilabel dengan DIG. Prosedur analisis
Southem, pelabelan probe dengan DIG, hybridisasi, dan deteksinya dilakukan berdasarkan rekomendasi
dari Roche. Untuk deteksi gen tersebut juga dilakukan dengan metode PCR. Oleh karena pada tahun
kedua dengan metode hibridisasi tidak memberikan hasil yang diharapkan maka pada tahun ketiga
dilakukan isolasi gene dengan metode PCR. Fragment-fragment DNA A. luteoviolaceus yang memberikan
signal tunggal positif selanjutnya diisolasi dan dikloning ke dalam plasmid untuk sekuensing. Selanjutnya
hasil sequencing dianalisis untuk mengetahui apakag gen halogenase dapat diperoleh.
Hasil yang sudah diperoleh dalam penelitian untuk tahun ke 3 ini adalah: (1) PCR dengan menggunakan
degenerate primer LFH1-for: 5’- ATC ATC GGY GGC GGC CCG GCC GG -3’ dan LFH4-rev: 5’- GGA GAA GAT
CGG GTC GAC GAA -3’ PCR dilakukan pada kondisi suhu enealing 52 – 72 oC dan suhu elongasi 68 oC
dengan memberikan signal pita pada ukuran sekitar 600 pb dan 1200 pb, (2) Hasil sekuensing fragmen
PCR yang diklon dalam plasmid pBluescript SK belum memberikan homologi yang signifikan dengan gen
halogenase, fragmen 1200 bp memberikan kemiripan 48% dengan FAD-binding 9 siderophoreinteracting domain containing protein dari Shewanella baltica OS223 (YP_002356062.1) dan dari
Shewanella sp. MR-7 (YP_36154.1). Mungkinkah ada harapan akan adanya FADH2-dependent
halogenase. Untuk ini saat ini masih dilakukan PCR dengan pasangan primer HalA-for/HalA-rev dan HalB-
for/HalB rev serta MPF1/MPR2, diharapkan pada bulan Desember sudah bisa dilaporkan hasil
analisisnya.