isolasi enzim selulase asal bakteri rumen sebagai

Prosiding Seminar Nasional Kimia Unesa 2011 – ISBN : 978-979-028-378-7
Surabaya, 19 Pebruari 2011
Isolasi Enzim Selulase dan Hemiselulase Asal Bakteri Rumen sebagai Bahan
Bioaktivator Pakan Ternak Ruminansia
Mirni Lamid
Departemen Peternakan
Fakultas Kedokteran Hewan, Universitas Airlangga
E-mail : [email protected]
Abstrak - Selulosa dan hemiselulosa merupakan polisakarida struktural sel tanaman
terbanyak di dalam dinding sel tanaman. Beberapa bakteri penghasil enzim selulase
dan hemiselulase yang mampu memecah selulosa dan hemiselulosa menjadi glukosa
dan hemiselulosa diantaranya adalah bakteri fibrolitik yang hidup di dalam rumen
ruminansia. Tujuan penelitian ini adalah untuk mengisolasi dan mengukur aktivitas
enzim selulase dan hemiselulase produksi bakteri rumen ternak sapi potong yang
dapat digunakan sebagai bahan bioaktivator dalam pakan ternak ruminansia. Uji
aktivitas enzim selulase dan hemiselulase dilakukan dengan cara menentukan jumlah
gula pereduksi yang terbentuk, yaitu dengan menggunakan metode DNS (asam 3,5dinitrosalisilat) sebagai substrat spesifik. Hasil yang diperoleh dari penelitian adalah
bakteri BR2 mampu menghasilkan enzim selulase dengan aktivitas sebesar 0,28
(U/ml), sedangkan bakteri BR1, BR2, BR3, BR4, BR5 mampu menghasilkan enzim
hemiselulase dangan aktivitas masing-masing sebesar 10,50, 22,63, 22,63, 8,75, 9,41
(U/ml).
Kanta kunci : selulase, hemiselulase, bakteri fibrolitik, ruminansia
PENDAHULUAN
Indonesia selain dikenal sebagai
negara yang memiliki keanekaragaman
hayati yang tinggi
juga dikenal
sebagai negara penghasil ternak
unggas
maupun
ruminansia.
Berkembangnya usaha peternakan
ruminansia di Indonesia seperti sapi,
kerbau,
kambing
dan
domba,
menyebabkan
angka
pencemaran
lingkungan meningkat akibat limbah
ternak yang dihasilkan. Limbah ternak
tersebut meliputi manure (feses dan
urine), darah, tulang, tanduk, isi rumen
dan lain-lain (Sihombing, 2000).
Berdasarkan
hasil
penelitian
Wibowomoekti (1997), salah satu
akibat dari pencemaran air oleh limbah
ternak ruminansia yang dialirkan ke
Sungai
Buaran
Jakarta
ialah
menurunnya kualitas air. Hal ini
disebabkan
oleh
meningkatnya
kandungan sulfida dan amoniak bebas
di atas kadar maksimum kriteria
kualitas air. Selain itu, limbah ternak
masih mengandung nutrisi atau zat
padat yang potensial untuk mendorong
kehidupan jasad renik, salah satu
diantaranya
adalah
isi
rumen
(Nurtjahya et al, 2003). Rumen
merupakan lingkungan yang sesuai
untuk
pertumbuhan
sejumlah
mikroorganisme. Di dalam rumen
terdapat sekitar 1010-1012 bakteri pada
tiap gram isi rumen (Ogimoto, 1981).
Bakteri rumen merupakan bakteri
anaerob (tanpa oksigen) dan fakultatif
anaerob (ada dan tanpa oksigen)
meskipun dalam jumlah kecil.
Selulosa adalah komponen
terbesar dari tanaman. Selulosa
merupakan suatu homopolisakarida
linier yang tersusun atas 100-4000 unit
monosakarida β-glukosa melalui ikatan
β-1,4-glikosidik (Tillman et al, 1991
dan Mc Donald et al, 1995).
B - 456
Prosiding Seminar Nasional Kimia Unesa 2011 – ISBN : 978-979-028-378-7
Surabaya, 19 Pebruari 2011
Hemiselulosa merupakan polimer
bakteri fibrolitik dalam rumen.
karbohidrat
kompleks
yang
Beberapa bakteri penghasil enzim
mempunyai berat molekul lebih rendah
selulase dan hemiselulase yang mampu
dari selulosa. Monomer-monomer
memecah ikatan lignin dengan selulosa
penyusun hemiselulosa adalah xilosa,
dan hemiselulosa diantaranya adalah
mannosa,
galaktosa,
glukosa,
bakteri yang hidup di dalam rumen
arabinosa, glukoronic, galakturonic
(Mathews et al, 1990). Ruminansia
dan glukoronic acids (Perez et al.,
(sapi, kambing, kerbau dan domba)
2002).
Hemiselulosa
memiliki
mampu memanfaatkan rumput dan
kesamaan dengan selulosa yaitu
limbah pertanian sebagai sumber
merupakan polimer dari unit-unit gula
energi dari hasil pemecahan selulosa
yang terikat oleh ikatan glikosidik,
dan hemiselulosa oleh enzim selulase
tetapi hemiselulosa berbeda dengan
dan hemiselulase yang dihasilkan oleh
selulosa dilihat dari segi komponen
mikroba fibrolitik di dalam rumen
unit gula yang menyusunnya, panjang
ruminansia.
Van
Soest
(1994)
rantai molekul dan percabangan rantai
menyatakan bahwa selulosa dan
molekul. Sebagian besar hemiselulosa
hemiselulosa dalam rumen ternak
berbentuk amorf dengan rantai
ruminansia
mengalami
proses
bercabang
pendek.
Derajat
fermentasi yang menghasilkan Volatile
polimerisasinya hanya 200 sehingga
Fatty Acid (VFA) yang dapat
lebih mudah mengalami reaksi
memenuhi 50 – 60 % kebutuhan
oksidasi dan degradasi dibandingkan
energi. Bahan limbah serat khususnya
selulosa (Sjostrom, 1995).
limbah pertanian akan menjadi bahan
Kelimpahan
selulosa
dan
bernilai tinggi apabila disamping
hemiselulosa di alam menjadikan
tingginya kandungan selulosa dan
peranan
enzim
selulase
dan
hemiselulosa, juga diwaktu yang sama
hemiselulase sangat penting untuk
kedua komponen tersebut harus dapat
proses
hidrolisis
selulosa
dan
dihidrolisis menjadi senyawa yang
hemiselulosa
(Campbell,
1995).
mudah
terfermentasi.
Hidrolisis
Pengembangan proses hidrolisis secara
hemiselulosa akan menghasilkan xilosa
enzimatis merupakan prospek baru
50 – 70 %, arabinosa 5 – 15 % dan
untuk
penanganan
limbah
hidrolisis selulosa akan menghasilkan
lignoselulosa dan lignohemiselulosa
glukosa (Pessoa et al., 1997).
yang akan dimanfaatkan untuk
Berdasarkan uraian tersebut
berbagai aplikasi. Proses tersebut akan
diatas maka tujuan penelitian ini
sekaligus melestarikan lingkungan dari
adalah untuk
mengisolasi enzim
limbah-limbah
lignoselulosa
dan
selulase dan hemiselulase yang
lignohemiselulosa yang berasal dari
diproduksi dari rumen sapi potong,
limbah pertanian dan industri pertanian
yang berpotensi sebagai bahan
yang sangat melimpah di Indonesia
bioaktivator dalam mendegrasi bahan
yang berpotensi sebagai pakan ternak
pakan ternak khususnya limbah
ruminansia dan unggas. Biodegradasi
pertanian yang berserat tinggi.
selulosa dan hemiselulosa secara
enzimatis dilakukan oleh enzim
Metode Penelitian
selulase dan hemiselulase yang
Sampel Penelitian
diproduksi
oleh
berbagai
Sampel yang digunakan adalah
mikroorganisme seperti jamur, bakteri
lima isolat bakteri fibrolitik hasil
dari
rumen
ternak
ruminansia
isolasi dari cairan rumen sapi potong
(Campbell, 1995). Selulase dan
(BR1, BR2, BR3, BR4, BR5) yang
hemiselulase banyak dihasilkan oleh
merupakan
stok
dari
koleksi
B - 457
Prosiding Seminar Nasional Kimia Unesa 2011 – ISBN : 978-979-028-378-7
Surabaya, 19 Pebruari 2011
Laboratorium
Makanan
Ternak
Uji aktivitas enzim selulase dengan
Universitas Airlangga.
metode
asam
3,5dinitrosalisilat (DNS)
Aktivitas selulase dilakukan
Prosedur Penelitian
dengan cara menentukan jumlah gula
Pembuatan media cair
Media cair terdiri dari 0,2 g
pereduksi yang terbentuk, yaitu dengan
trypton; 0,1 g yeast ekstrak; 0,2 g
menggunakan metode DNS (asam 3,5NaCl. Semua bahan dilarutkan dalam
dinitrosalisilat)
menggunakan
labu Erlenmeyer 100 ml dengan 20 ml
Carboxymethyl
cellulose
(CMC)
akuades. Kemudian ditutup dengan
sebagai substrat spesifik. Aktivitas
kapas dan aluminium foil. Larutan ini
endo-1,4-β-D-glucanase diuji dengan
disterilkan dengan autoklaf selama 45
mencampurkan 100 l enzim dan 100
o
menit pada suhu 121 C dan tekanan 1
l substrat (1% CMC dalam 0,1 M
atm.
bufer fosfat sitrat pH 7) dimasukkan
dalam tabung Ependorf, diinkubasi
dalam penangas air pada 50oC selama
Pembuatan media padat
30 menit. Sejumlah gula pereduksi
Media cair terdiri dari 0,2 g
yang terbentuk diukur aktivitas
trypton; 0,1 g yeast ekstrak; 0,2 g
enzimnya menggunakan metode asam
NaCl; 0,3 g bacto agar. Semua bahan
3,5-dinitrosalisilat (DNS) yaitu dengan
dilarutkan dalam labu Erlenmeyer 100
menambahkan 600 µl DNS ke dalam
ml dengan 20 ml akuades. Kemudian
tabung, lalu dimasukkan dalam
ditutup dengan kapas dan aluminium
penangas air mendidih selama 15
foil. Larutan ini disterilkan dengan
menit bersama-sama dengan kontrol
autoklaf selama 45 menit pada suhu
(mengandung 100 µl enzim ditambah
121oC dan tekanan 1 atm.
600 µl DNS dan 100 µl substrat tetapi
Selanjutnya setelah dikeluarkan
tanpa inkubasi) kemudian didinginkan
dan sterilisator campuran atau medium
dalam air es selama 20 menit. Volume
ditunggu sampai suam-suam kuku.
total uji aktivitas enzim dengan metode
Lalu medium dituang ke dasar cawan
DNS dalam penelitian ini sebanyak
petri dan dibiarkan sampai menjadi
800
µl,
sehingga
pengukuran
dingin dan padat.
absorbansi dilakukan menggunakan
cuvet plastik. Selanjutnya, absorbansi
Produksi enzim selulase
dibaca dengan Spektrofotometer pada
Produksi
enzim
selulase
λ 550 nm. Satu unit aktivitas enzim
dilakukan dengan menginokulasikan
telah didefinisikan sebagai banyaknya
1% inokulum ke dalam 100 ml media
enzim
yang
diperlukan
untuk
cair yang mengandung Carboxymethyl
membentuk 1mol produk per satuan
Cellulose (CMC) dalam erlenmeyer
waktu untuk setiap ml enzim (Miller,
500 ml dan diinkubasi pada suhu 39oC
1960; Puspaningsih, 2004).
selama 16 jam dengan penggoyangan
150 rpm. Hasil inkubasi kemudian
Produksi Enzim Hemiselulase
disentrifugasi dengan kecepatan 8000
Sebanyak satu ose koloni
rpm selama 15 menit dan diambil
tunggal lima isolat bakteri fibrolitik
supernatannya untuk diuji aktivitas
dimasukkan ke dalam 20 ml media
enzim selulasenya. Ekstrak kasar
cair,
diinkubasi
dalam
shaker
enzim selulase adalah supernatan
inkubator selama 16 jam pada suhu
sedangkan pelet selnya dibuang.
39 0C. Kultur selanjutnya disentrifuge
dengan kecepatan 6000 rpm pada suhu
39 0C selama 15 menit. Pelet dibuang,
B - 458
Prosiding Seminar Nasional Kimia Unesa 2011 – ISBN : 978-979-028-378-7
Surabaya, 19 Pebruari 2011
sedangkan
supernatan
yang
unit enzim dibagi kadar protein
mengandung
enzim
hemiselulase
(Miller, 1960).
diambil untuk digunakan analisis
selanjutnya.
Hasil dan Pembahasan
Uji Aktivitas Hemiselulase dengan
Hasil seleksi 5 isolat bakteri
metode asam 3,5-dinitrosalisilat
fibrolitik masing-masing menggunakan
(DNS)
Masing-masing sebanyak 100
carboxyl methyl cellulase (CMC) dan
oat splet xilan sebagai substrat.
l enzim dan substrat hemiselulase
Aktivitas selulase dan hemiselulase
dimasukkan
ke
dalam
tabung
ekstraseluler menunjukkan hasil positif
Eppendorf kemudian diinkubasi pada
0
yang ditandai halo (pembentukan zona
suhu 39 C dalam penangas air selama
bening disekeliling koloni sel) pada
1 jam. Untuk kontrol campurannya
media padat. Dari 5 isolat bakteri yang
sama seperti sampel tetapi tidak
digunakan terdapat 1 bakteri isolat
diinkubasi. Sampel dan kontrol lalu
BR2 yang memberikan indeks halo
ditambahkan 600 l DNS, Selanjutnya
terbesar yaitu 1,5 cm pada media CMC
dipanaskan dalam air mendidih selama
dan 1,4 cm pada media oat splet xylan.
15 menit, lalu diinkubasi dalam
Berdasarkan hasil seleksi pada 5 isolat
icebath selama 20 menit. Absorbansi
bakteri lignoselulolitik yaitu BR1,
dibaca pada panjang gelombang 550
BR2, BR3, BR4, BR5 diperoleh isolat
nm.
1 Unit aktivitas enzim
BR2 yang mempunyai aktivitas
didefinisikan sebagai jumlah enzim
tertinggi,
masing-masing aktivitas
yang menghasilkan 1 mol xilosa per
selulase
sebesar
0,28 U/ml dan
menit untuk setiap ml enzim,
aktivitas
hemiselulase
sebesar 8,75sedangkan aktivitas spesifik adalah
22,63 U/ml.
Tabel 1. Data Aktivitas Isolat Penghasil Enzim Selulase dan Hemiselulase Asal
Bakteri Rumen
Aktivitas enzim selulase
Aktivitas enzim hemiselulase
(U/ml)
(U/ml)
BR1
-
10,50
BR2
0,28
22,63
BR3
-
22,63
BR4
-
8,75
BR5
-
9,41
Isolat
B - 459
Aktivitas enzim hemiselulase (U/ml)
Prosiding Seminar Nasional Kimia Unesa 2011 – ISBN : 978-979-028-378-7
Surabaya, 19 Pebruari 2011
25
20
15
Series1
10
5
0
1
2
3
4
5
Isolat bakteri
Gambar 1. Aktivitas enzim hemiselulase (U/ml)
Uji aktivitas enzim selulase dan
hemiselulase dilakukan dengan metode
DNS yang bertujuan untuk mengetahui
adanya gugus aldehid pada gula
pereduksi yang selanjutnya dioksidasi
menjadi
karboksil.
Asam
3,5dinitrosalisilat direduksi menjadi asam
3-amino-5-nitrosalisilat dalam kondisi
basa. Perubahan warna kuning asam
3,5-dinitrosalisilat menjadi kecoklatan
dari asam 3-amino-5nitrosalisilat.
Adanya gugus aldehid ditandai dengan
perubahan warna kuning menjadi
kecoklatan. Gugus aldehid ini berasal
dari
selulo-oligosakarida
hasil
hidrolisis selulosa oleh enzim selulase
dan xilo-oligosakarida hasil hidrolisis
hemiselulosa oleh enzim hemiselulase
(Miller, 1950).
Menurut la Granga et al. (1996)
beberapa spesies bakteri dan jamur
dapat menggunakan selulosa dan
hemiselulosa sebagai sumber karbon
karena mampu menghasilkan selulase
dan hemiselulase. Dikatakan oleh
Kulkarni et al. (1999) sebagian besar
bakteri dan jamur mensekresikan
selulase dan hemiselulase ektraseluler
yang akan memecah selulosa menjadi
glukosa, dan hemiselulosa menjadi
xilosa dan glukosa
sehingga
mikroorganisme
tersebut
dapat
menggunakan glukosa dan xilosa
untuk pertumbuhannya.
Hidrolisis
selulase
dan
hemiselulase membutuhkan aktivitas
sinergisme dari berbagai enzim
selulase dan hemiselulase dengan
spesifikasi
yang
berbeda-beda
menghasilkan sistem multienzim.
Struktur
kimia
selulosa
dan
hemiselulosa yang sangat bervariasi
selaras dengan bervariasinya selulase
dan hemiselulase yang mempunyai
aktivitas selulolitik dan hemiselulolitik
yang berbeda-beda. Sistem multienzim
dari selulase dan hemiselulase adalah
suatu strategi dari mikroorganisme
untuk
meningkatkan
efektivitas
hidrolisis selulosa dan hemiselulosa,
dimana setiap enzim mempunyai
fungsi spesifik (Beg et al., 2001).
Selulosa dan hemiselulosa
merupakan polisakarida terbesar dalam
penyusunan dinding sel tanaman.
Hidrolisis
hemiselulosa
akan
menghasilkan xilosa 50 – 70 %,
arabinosa 5 – 15 % dan hidrolisis
selulosa akan menghasilkan glukosa
(Pessoa et al., 1997). Keberadaan
selulosa dan hemiselulosa yang
bersifat
dapat
diperbaharuhi
(renewable resources) menjadi produk
yang mempunyai potensi berguna
sebagai sumber energi bagi ternak
ruminansia.
B - 460
Prosiding Seminar Nasional Kimia Unesa 2011 – ISBN : 978-979-028-378-7
Surabaya, 19 Pebruari 2011
Enviromental Microbiology
Kesimpulan
Dari hasil penelitian yang telah
67:5512-5519.
dilakukan dapat diambil kesimpulan
Mathews, C.K., Van Holde, K.E.,
sebagai berikut:
Kelima isolat
1990,
Biochemistry,
fibrolitik dipilih 1 isolat terpilih BR2
Benjamin/Cummings
yang memiliki indeks halo masingPublishing Company lnc :
masing 1,5 cm dan 1,4 cm, aktivitas
USA. Pp 282-285.
enzim selulase sebesar 0,28 U/ml dan
Mc Donald, P., R.A. Edwards and
aktivitas enzim hemiselulase tertinggi
J.F.D. Greenhalgh, 1995,
sebesar
22,63
U/ml,
sehingga
Animal
Nutrition,
Third
membuktikan bahwa isolat BR2
Edition, Logman, London and
memiliki aktivitas positif terhadap
New York.
selulase dan hemiselulase. Enzim
Miller, Gail Lorenz, 1960, Use of
selulase dan hemiselulase berpotensi
Dinitrosalicylic Acid Reagent
sebagai
bioaktivator
untuk
for
Determination
of
mendegradasi bahan limbah pertanian
Reducing Sugar, Analytical
yang berserat tinggi sebagai sumber
Chemistry., 31 : 426-428.
energi bagi ternak ruminansia.
Nurtjahya,
E.,
Rumetor,
S.D.,
Salamena,
J.F.,
2003,
Pemanfataan Limbah Ternak
Ruminansia
untuk
DAFTAR PUSTAKA
Mengurangi
Pencemaran
Beg QKM, Kapoor L, Mahajan G,
Lingkungan,
Makalah
Hoondal S., 2001, Microbial
Pengantar Falsafah Sains,
Xylanase from The Newly
Program Pasca Sarjana S-3,
Isolated Bacillus sp. Strain
Institut Pertanian Bogor.
BP-23, Can J Microbial 39 :
Ogimoto, 1981., Size Fractination of a
1162-1166.
Rumen Microbial Population
Campbell,
Mary
K.,
1995,
by
Counter
Centrifugal,
Biochemistry,
Second
Journal of Microbiological
Edition, Mount Holyoke
Method, Volume 67, Issue 3.
College, Saunders College
Pessoa, A.JR., I.M. Mancilha and
Publishing : United States of
S.Sato. 1997. Acid hydrolysis
America. Pp 330-332.
of
hemicellulose
from
Kulkarni., A. Shendye, and M. Rao.
Surgacane Bagasse. Braz. J.
1999,
Molecular
and
Chem. Eng. Vol 14 No.3. Sao
Biotechnological a Spects of
Paolo.
Xylanases, FEMs Microbial.
Sihombing, D.T.H., 2000, Teknik
Rev. 23:411-456.
Pengolahan
Limbah
La Grange, D.C., Pretorius I.S..,
Kegiatan/Usaha Peternakan,
Glaeyssens M., Van Zhyl
Pusat Penelitian Lingkungan
W.H. 2001. Degradation of
Hidup Lembaga Penelitian,
xylan to D-xylose by
Institut Pertanian Bogor.
recombinant
Saccromyces
Sjostrom, E. 1995. Kimia Kayu,
cerevisiae coexpressing the
Dasar-dasar
dan
Aspergillus
niger
ßPenggunaannya
xylosidase (XylO) and the
diterjemahkan oleh Hardjono
Trichoderma resei xylanase
Sastrohamidjoyo), Cetakan
(Xyn 2) genes. Applied and
pertama. Penerbit UGM
Press, Yogyakarta.
B - 461
Prosiding Seminar Nasional Kimia Unesa 2011 – ISBN : 978-979-028-378-7
Surabaya, 19 Pebruari 2011
Tillman,
A.D.H.
Hartadi,
S.
ed. Cornell University Press
Reksohadiprodjo,
S.
Ithaca and London.
Prawirokusumo
dan
S.
Wibowomoekti
P.S.,
1997,
Labdosukojo, 1991, Ilmu
Kandungan Salmonella spp.
Makanan
Ternak
Dasar,
dari Limbah Cair Rumah
Cetakan kelima, Gajah Mada
Potong Hewan (Studi Kasus
University Press, Yogyakarta.
RPH Cakung, Jakarta), Tesis
Van Soest, P.J. 1994. Nutritional
Program Pascasarjana Institut
nd
Ecology of the Ruminant, 2
Pertanian Bogor, Bogor.
B - 462