1 BAB I PENGANTAR A. LATAR BELAKANG

BAB I
PENGANTAR
A. LATAR BELAKANG PERMASALAHAN
Kanker merupakan salah satu penyakit tidak menular yang menjadi
permasalahan kesehatan utama di dunia. Pada tahun 2004 kematian akibat kanker
mencapai 7,4 juta dan pada tahun 2015 diperkirakan menjadi 83,2 juta. Jumlah
penderita kanker akan terus bertambah apabila tidak ada upaya penanggulangan
secara optimal. Jenis kanker yang menduduki urutan pertama di Indonesia dari tahun
2004 – 2008 adalah kanker payudara (WHO, 2008). Kanker payudara lebih sering
diderita kaum wanita dari pada pria dan merupakan penyebab kematian utama kaum
wanita, dengan persentase kematian sebesar 15 % dari semua kematian wanita yang
mengalami kanker (Tjindarbumi & Mangunkusumo, 2002; Pazdur et al., 2009). Pada
tahun 2011 kematian akibat kanker payudara di Amerika menduduki urutan kedua,
diperkirakan ada 230.480 kasus kanker payudara dan sekitar 39.520 berujung pada
kematian (deSantisc et al., 2011).
Berbagai metode penyembuhan kanker telah dilakukan seperti pembedahan,
penyinaran, kemoterapi, dan imunoterapi namun masing-masing metode mempunyai
kelemahan sehingga tingkat keberhasilannya masih rendah (Hoffman, 1999). Sejumlah
besar tumor merespon sangat buruk bahkan tidak merespon sama sekali terhadap obatobatan terapetik dan radioterapi (Girdhani et al., 2005). Keberhasilan pengobatan
kanker yang masih rendah ini mendorong peneliti di dunia berlomba- lomba mencari
antikanker baru baik melalui sintesis senyawa organik maupun eksplorasi senyawa aktif
dari bahan alam yang secara empirik digunakan oleh masyarakat untuk mengobati
kanker. Berbagai strategi dilakukan dalam usaha menemukan antikanker baru yang
lebih sensitif dan spesifik. Salah satu usaha yang banyak dilakukan dalam menemukan
antikanker baru adalah melalui eksplorasi bahan alam terutama tanaman obat. Bahan
1
alam terbukti merupakan sumber antikanker baru yang potensial. Beberapa antikanker
yang tersedia saat ini merupakan hasil isolasi dari bahan alam seperti vinkristin dan
vinbrastin dari tanaman Catharanthus roseus, taksol dari Taxus brevifolia dan
campotensin dari Camptotheca acuminata (Cragg et al., 1994).
Bahan alam yang potensial dikembangkan sebagai antikanker diantara
senyawa aktif adalah senyawa golongan flavonoid. Flavonoid adalah metabolit sekunder
dengan dua cincin benzen yang dihubungkan dengan 3 karbon. Isoflavon merupakan
salah satu senyawa golongan flavonoid selain flavon, flavonol, flavonon, dan
antosianidin (Harbone & William, 2000). Isoflavon terbukti mempunyai berbagai aktivitas
farmakologis seperti antioksidan, antiinflamasi, antimutagenik, dan antikanker (Yoshida,
1995; Zhao-O, 1995; Chahar et al., 2011).
Isoflavon banyak dijumpai pada biji kedelai, senyawa ini memiliki struktur mirip
dengan 17-β estradiol manusia sehingga mampu mempengaruhi kadar hormon wanita
pra- dan pascamenoupause (Steine et al., 2008). Pada studi epidemiologi didapatkan
adanya penurunan risiko kanker payudara sebesar 3 kali lipat pada populasi Asia yang
konsumsi kedelainya sangat
tinggi (Hooper
et
al.,
2010). Genistein (7,4’-
dihidroksiisoflavon), daidzein (5,7,4’-trihidroksiisoflavon), biokanin A (5,7-dihidroksi-4’metoksiisoflavon),
dan
formononetin
(7-hidroksi-4’-metoksiisoflavon)
merupakan
golongan isoflavon yang diisolasi dari kedelai (Gycine max, L) (Gambar 1).
H
O
H
O
H
H
O
H
OH
H
CH 3
Biokanin A
Genistein
H
O
O
H
O
H
H
O
Formononetin
CH 3
H
OH
O
H
Daidzein
Gambar 1. Senyawa turunan isoflavon hasil isolasi dari kedelai (Guo et al., 2004).
2
Senyawa-senyawa turunan isoflavon alami tersebut terbukti mempunyai
aktivitas antikanker pada berbagai jenis kanker seperti kanker ovarium (Choi et al.,
2007; Taylor et al., 2004), kanker payudara (Choi dan Kim, 2008; Li et al., 2008), kanker
serviks (Guo et al., 2004), melanoma (Wang et al., 2002), hepatokarcinoma (Yeh et al.,
2007), dan adenokarsinoma paru (Zou et al., 2008).
Meskipun turunan isoflavon terutama genistein dan daidzein aktif pada
berbagai jenis kanker dan potensial untuk dikembangkan lebih lanjut menjadi antikanker
tetapi ketersediaanya sangat terbatas. Hasil isolasi dari kedelai tidak menguntungkan
secara ekonomis karena biaya isolasi mahal. Untuk mengatasi keterbatasan
ketersediaan senyawa isoflavon dan mengembangkan bahan alam Indonesia sebagai
bahan baku obat Hairil et al. (2010) mensintesis senyawa turunan isoflavon dari bahan
baku minyak cengkeh (eugenol) yang banyak tersedia di Indonesia yaitu 1,2-Epoksi-3[33’4’-dimetoksifenil)-4H-1-benzopiran-4-on]propana (Gambar 2).
Gambar 2. Senyawa 1,2-Epoksi-3[3-(3,4-dimetoksifenil)-4H-1-benzopiran-4on)propana (Hairil et al., 2010)
Berdasarkan hasil uji aktivitas sitotoksik senyawa 1,2-Epoksi-3[3-(3,4dimetoksifenil)-4H-1-benzopiran-4-on)propana didapatkan bahwa senyawa tersebut
merupakan senyawa
aktif, memiliki IC50 yang rendah hampir sama dengan IC50
doksorubicin dan tamoksifen (Lampiran 2). Pada cell line T47D, senyawa 1,2-Epoksi3[3-(3,4-dimetoksifenil)-4H-1-benzopiran-4-on)propana
memiliki IC50 sebesar 14,94
µg/mL, sedangkan IC50 doksorubicin sebesar 10,29 µg/mL dan tamoksifen sebesar
18,65 µg/mL pada cell line MCF-7 senyawa 1,2-Epoksi-3[3-(3,4-dimetoksifenil)-4H-1benzopiran-4-on)propana memiliki IC50 sebesar 18,56 µg/mL sedangkan doksorubicin
3
sebesar 26,75 µg/mL dan tamoksifen sebesar 28,79 µg/mL (Lampiran 9). Hasil IC50
senyawa
1,2-Epoksi-3[3-(3,4-dimetoksifenil)-4H-1-benzopiran-4-on)propana
yang
tidak berbeda jauh dengan doksorubicin maupun tamoksifen memungkinkan senyawa
tersebut dapat diteliti lebih lanjut kemampuannya dalam menghambat pertumbuhan sel
kanker. Pengujian terhadap sel Vero untuk menguji keamanan senyawa. Pengujian
dilakukan pada konsentrasi 100, 200, 400, 800, dan 1600 µL (Lampiran 6) didapatkan
bahwa
senyawa
1,2-Epoksi-3[3-(3,4-dimetoksifenil)-4H-1-benzopiran-4-on)propana
merupakan senyawa yang aman terhadap sel normal karena pada sel Vero memiliki
IC50 yang sangat tinggi.
Meskipun telah berhasil disintesis tetapi senyawa 1,2-Epoksi-3[3-(3,4dimetoksifenil)-4H-1-benzopiran-4-on)propana belum pernah dikaji aktivitas sitotoksik
dan mekanisme molekuler pada sel kanker. Oleh karena itu kajian terhadap mekanisme
molekuler terhadap senyawa tersebut perlu dilakukan.
Beberapa obat kemoterapi diharapkan bekerja secara spesifik dapat mengatur
aktivitas empat kelompok gen yang terlibat pada sel kanker sehingga fungsi sel dapat
berjalan normal kembali. Empat kelompok gen tersebut yaitu gen yang berperan dalam
peningkatan ekspresi onkogen (misalnya, erb-B2), gen yang terlibat dalam gen supresor
hormon (misalnya, p53), gen yang berperan pada perbaikan DNA (misalnya, BRCA-1
dan BRCA-2), dan gen yang berperan pada siklus sel (misalnya, cyclin D) (Lai et al.,
2012). Onkogen
merupakan
kelompok
gen
yang terlibat pada transformasi
keganasan. Onkogen terlibat dalam pengaturan pertumbuhan dan diferensiasi sel. Pada
pertumbuhan
sel
normal,
gen
yang
berhubungan
dengan
onkogen
adalah
protoonkogen. Onkogen terjadi karena mutasi gen atau perubahan susunan pada DNA
protoonkogen sehingga terjadi perubahan fungsi gen (Sander et al., 2008). Gen supresor
pada etiologi kanker berperan menekan pertumbuhan dan proliferasi sel kanker, kanker
akan muncul apabila gen ini tidak diekspresikan atau terjadi mutasi noktah sehingga
4
protein inaktif (Cotran et al., 2005). Gen yang terlibat pada perbaikan DNA antara lain
adalah BRCA1 dan BRCA2. Gen BRCA1 dan BRCA2 dibutuhkan untuk menjaga
kestabilan kromosom dan berperan besar pada kerusakan DNA (Venkitaraman, 2001).
Gen yang berperan pada siklus sel adalah cyclin, cyclin akan berikatan dengan Cdk
(cyclin dependent kinase) dan ikatan ini berperan untuk mengontrol fosforilasi. Ada
beberapa jenis cyclin yaitu cyclin A, B, D dan E yang berada pada siklus sel yang
berlainan (Albert et al., 2005). Ke-4 kelompok gen tersebut berperan pada aktivitas
biologis yaitu antara lain pada proses apoptosis, proliferasi sel, angiogenesis, adhesi
dan migrasi sel (Contran et al., 2005).
Isoflavon sebagai salah satu turunan flavanoid diketahui memiliki efek
menghambat COX-2, juga menghambat protein COX-2-independent lainnya seperti Akt,
nuclear
factor
kappaB
(NF-κB)
dan
mitogen
activated
protein
kinase
(MAPK)/extracellular–signal-regulated kinase 1/2 (ERK1/2). Alpha serine (Akt)
mempunyai peranan penting dalam regulasi pertahanan siklus sel dan proliferasi sel
kanker dengan mempengaruhi aktivitas fosforilasi berlebihan dari Akt. Adanya
pengeblokan
signal
tersebut
menyebabkan
hambatan
pertumbuhan
dengan
penghentian siklus sel dan apoptosis dari sel kanker. Nuclear factor kappaB (NF-kB)
merupakan faktor transkripsi yang berperan dalam regulasi ekspresi gen yang terlibat
dalam fungsi seluler yang luas yaitu apoptosis, replikasi, tumorgenesis, proliferasi,
angiogenesis, metastasis dan siklus sel. Nuclear factor kappaB (NF-κB) meregulasi
ekspresi beberapa produk gen yang berhubungan dengan karsinogenesis (Minakandan
et al., 2009; Baud dan Karin, 2009). Mitogen-activated protein kinase (MAPK/ERK ½)
mempunyai peran penting di dalam regulasi angiogenesis sel kanker (Kobayashi, 2006).
Pertumbuhan sel kanker sangat memerlukan aktivitas angiogenesis. Oleh karena
angiogenesis pada sel kanker sangat penting untuk pertumbuhan kanker maka proses
angiogenesis dapat menjadi target penting untuk menekan pertumbuhan kanker dan
5
metastasis. Angiogenesis diperlukan pada hampir setiap langkah perkembangan tumor
dan metastasis, sehingga vaskularisasi tumor merupakan penanda prognostik yang kuat
untuk derajat tumor. Sel yang berperan banyak pada angiogenesis adalah sel endotel
dan menjadi target untuk terapi antiangiogenesis. Molekul yang berperan pada
proliferasi sel endotel dan permeabilitas vaskuler adalah Vascular Endothelial Growth
Factor 2 (VEGFR-2) (Ferrara et al., 2003). Proliferasi sel endotel diregulasi melalui
aktivasi a SH2-domain dan PLCγ yang mengandung molekul dan berinteraksi langsung
dengan
VEGFR-2
melalui
fosforilasi
mitrogen
activated
protein
kinase
(MAPK)/extracellular –signal-regulated kinase 1/2 (ERK1/2 (Takahashi et al., 2001).
Vascular endothelial growth factor menambah kemampuan hidup sel endotel
menggunakan jaras PI3K/AKT dan menstimulasi migrasi sel endotel melalui fosforilasi
p38 MAPK (Kobayashi, 2006).
Mengacu pada hasil penelitian tentang isoflavon sebagai fitokimia bioaktif yang
memiliki struktur yang mirip dengan 17-β estradiol manusia sehingga mampu
mempengaruhi kadar hormon pada wanita pra- dan paskamenopause, maka senyawa
turunan isoflavon dari bahan baku minyak cengkeh (eugenol) perlu dikaji
kemampuannya sebagai antikanker secara in vitro dan in vivo. Kajian in vitro perlu
dilakukan dengan memilih cell line adenocarcinoma payudara yang memiliki perbedaan
pada rasio reseptor estrogen (ER)α dibandingkan (ER)ß. Pada penelitian ini
menggunakan cell line MCF-7 dan T47D karena kedua cell line ini memiliki reseptor
estrogen positif akan tetapi berbeda pada ratio ERα/ERß. Cell line MCF-7 memiliki ratio
ERα/ERß tinggi sedangkan cell line T47D memiliki ratio ERα/ERß rendah (Kinder dan
Aulthouse, 2004). Sedangkan kajian in vivo untuk pemicu timbulnya nodul payudara
pada hewan model dengan induksi 7,12 dimethylbenzo(A) antracene (DMBA). Metabolit
DMBA merupakan inisiator untuk pembentukan adenocarcinoma payudara (Miyata et
al., 2001).
6
B. PERUMUSAN MASALAH
Isoflavon sebagai fitokimia bioaktif yang memiliki struktur yang mirip dengan
17-β estradiol manusia sehingga mampu mempengaruhi kadar hormon pada wanita pradan pascamenopause dan terbukti menghambat interaksi, aktivasi reseptor estrogen
dengan signaling molekul. Isoflavon diketahui memiliki efek menghambat COX-2, juga
menghambat protein COX-2-independent lainnya seperti alpha serine (Akt), nuclear
factor kappaB (NF-κB) dan mitogen activated protein kinase (MAPK)/extracellular–
signal-regulated kinase 1/2 (ERK1/2). Akt berperan dalam regulasi pertahanan siklus sel
dan proliferasi sel kanker dengan mempengaruhi aktivitas fosforilasi berlebihan dari Akt.
Nuclear factor kappaB (NF-kB) merupakan faktor transkripsi yang berperan dalam
regulasi ekspresi gen yang terlibat dalam fungsi seluler yang luas yaitu apoptosis,
replikasi, tumorgenesis, proliferasi, angiogenesis, metastasis dan siklus sel.
Hasil uji aktivitas sitotoksik menunjukkan bahwa senyawa 1,2-Epoksi-3[3-(3,4dimetoksifenil)-4H-1-benzopiran-4-on)propana memiliki aktivitas sitotoksik yang tinggi
pada cell lines T47D dan MCF-7 dan rendah pada sel Vero.
Berdasarkan uraian perumusan masalah
tersebut diatas, maka diajukan
masalah penelitian sebagai berikut:
1. Apakah senyawa 1,2-Epoksi-3[3-(3,4-dimetoksifenil)-4H-1-benzopiran-4-on)propana
mempunyai aktivitas sitotoksik dan mekanisme molekuler in vitro pada cell lines
kanker payudara T47D dan MCF-7? Melalui kemampuan senyawa 1,2-Epoksi-3[3(3,4-dimetoksifenil)-4H-1-benzopiran-4-on)propana
a. Apakah menghambat proliferasi sel kanker payudaraT47D?
b. Apakah menghambat proliferasi sel kanker payudara MCF-7?
c. Apakah mnstimulasi apoptosis sel kanker payudaraT47D?
d. Apakah menstimulasi apoptosis sel kanker payudara MCF-7?
e. Apakah menghambat ekspresi VEGF pada sel kanker payudara T47D?
7
f. Apakah menghambat ekspresi VEGF pada sel
kanker payudara MCF-7?
g. Apakah menghambat ekspresi COX-2 pada sel kanker payudara T47D?
d. Apakah menghambat ekspresi COX-2 pada sel kanker payudara MCF-7?
2. Apakah senyawa 1,2-Epoksi-3[3-(3,4-dimetoksifenil)-4H-1-benzopiran-4 on)propana
memiliki aktivitas antikanker in vivo? Ditunjukkan melalui kemampuan senyawa 1,2Epoksi-3[3-(3,4-dimetoksifenil)-4H-1-benzopiran-4 on)propana
a. Apakah menghambat terbentuknya nodul payudara tikus Spraque Dawley (SD)
yang diinduksi DMBA?
b. Apakah menghambat pertambahan besar nodul payudara tikus Spraque Dawley
(SD) yang diinduksi DMBA?
c. Apakah memperbaiki gambaran histopatologi payudara tikus Spraque Dawley (SD)
yang diinduksi DMBA?
3. Apakah senyawa 1,2-Epoksi-3[3-(3,4-dimetoksifenil)-4H-1-benzopiran-4 on)propane
mempunyai mekanisme molekuler in vivo? Melalui kemampuan 1,2-Epoksi-3[3-(3,4dimetoksifenil)-4H-1-benzopiran-4 on)propane
a. Apakah menghambat proliferasi sel kanker pada nodul payudara tikus Spraque
Dawley (SD) yang diinduksi DMBA?
b. Apakah menghambat angiogenesis pada nodul payudara tikus Spraque Dawley
(SD) yang diinduksi DMBA?
C. KEASLIAN PENELITIAN
Beberapa penelitian tentang aktivitas antikanker senyawa turunan isoflavon
telah dilakukan oleh beberapa peneliti. Unger et al. (2003) telah berhasil mengisolasi
senyawa turunan isoflavon dari kedelai (Glycine max L) adalah 5,7,4’-trihidrosiisoflavon7-0-monoglukosida (genistein), 7,4’-dihidroksiisoflavon-7-0-monoglukosida (daidzein),
dan 7-dihidroksi-6,4’-metoksiisoflavon-7-0-monoglukosida (glisitin) dan menguji aktivitas
8
sitotoksiknya. Genistein sebagai senyawa isoflavon dilaporkan mampu menginduksi
apoptosis sel kanker payudara MDA-MB-231 (Li et al., 2008) dan 7-hidroksi-3’,4’benzoisoflavon aktif terhadap sel osteocarcinoma (Hou et al., 2008). Genistein juga
dapat menghambat proliferasi dan menginduksi apoptosis terhadap adenokarsinoma
paru cell line SPS-A1 (Li et al., 2008; Yeh et al., 2007; Choi dan Kim., 2008; Marini et
al., 2007; Zou et al., 2008; Chen et al., 2008).
Senyawa 1,2-Epoksi-3[3-(3,4-dimetoksifenil)-4H-1-benzopiran-4 on)propana
yang menjadi objek penelitian ini merupakan senyawa baru yang disintesis dari eugenol
minyak daun cengkeh dan belum dikaji aktivitas sitotoksik, mekanisme molekuler
terutama pada cell line karcinoma payudara serta aktivitas antikanker dan mekanisme
molekulernya pada hewan coba.
D. MANFAAT PENELITIAN
1. Manfaat Teoritis
Penelitian ini dikembangkan untuk mencari senyawa baru bagi penyakit
kanker. Secara teoritis manfaat yang diharapkan dari penelitian ini adalah untuk
mengungkapkan
kemampuan
senyawa
1,2-Epoksi-3[3-(3,4-dimetoksifenil)-4H-1-
benzopiran-4 on)propana dalam menghambat perkembangan kanker meliputi aktivitas
sitotoksik dan mekanisme sitotoksik pada cell line MCF-7 dan T47D, serta aman untuk
sel normal yaitu sel Vero. Disamping itu juga aktivitas antikanker dan mekanisme
molekuler pada nodul yang terbentuk di payudara tikus Spraque Dawley (SD) yang
diinduksi DMBA. Dalam
pengembangan ilmu pengetahuan dan teknologi, hasil
penelitian ini diharapkan dapat menjadi informasi tentang aktivitas sitotoksik dan
molekuler senyawa 1,2-Epoksi-3[3-(3,4-dimetoksifenil)-4H-1-benzopiran-4 on)propana
in vitro pada cell line MCF-7 dan T47D; dan aktivitas antikanker dan mekanisme
molekuler senyawa trsebut in vivo pada hewan coba tikus SD yang diinduksi DMBA.
9
2. Manfaat praktis
Dalam pengembangan obat kanker untuk mendapatkan obat antikanker yang
lebih sensitif dan lebih spesifik. Adapun manfaat bagi pembangunaan nasional, hasil
penelitian ini diharapkan dapat bermanfaat sebagai salah satu terapi untuk kanker
khususnya kanker payudara.
E. TUJUAN PENELITIAN
1.Tujuan Umum
Secara umum, penelitian ini bertujuan untuk mengungkapkan aktivitas molekuler
senyawa 1,2-Epoksi-3[3-(3,4-dimetoksifenil)-4H-1-benzopiran-4-on)propana in vitro
pada cell line T47D dan MCF-7 , dan in vivo pada tikus Spraque Dawley (SD) yang
diinduksi 7,12-Dimetibenz(a) Anthracene (DMBA).
2.Tujuan Khusus
a.Menganalisis mekanisme molekuler antikanker in vitro pada cell lines T47D dan
MCF-7 senyawa 1,2-Epoksi-3[3-(3,4-dimetoksifenil)-4H-1-benzopiran-4on)propana
melalui pengaruhnya terhadap hambatan proliferasi sel, peningkatan apoptosis,
dan penurunan ekspresi COX-2 dan VEGF.
b.Menganalisis aktivitas antikanker in vivo pada payudara tikus Spraque Dawley
(SD) yang diinduksi DMBA dan senyawa 1,2-Epoksi-3[3-(3,4-dimetoksifenil)-4H-1benzopiran-4-on)propana melalui hambatan terbentuknya dan pertambahan besar
nodul serta memperbaiki gambaran histopatologi payudara tikus.
c. Menganalisis aktivitas antikanker in vivo pada payudara tikus Spraque Dawley (SD)
yang diinduksi DMBA dan senyawa 1,2-Epoksi-3[3-(3,4-dimetoksifenil)-4H-1benzopiran-4-on)propana melalui pengaruhnya terhadap hambatan proliferasi sel
dan angiogenesis.
10